研究背景

　　乳腺癌是世界上最常见的女性癌症，分为不同的亚型。目前主要根据肿瘤的激素受体(hormone receptor, HR)和人表皮生长因子受体-2(Human Epidermal GrowthFactor Receptor 2, HER2)的状态进行治疗。其中HR阳性/HER2阴性(HR+/HER2-)乳腺癌是最常见的类型，占所有乳腺癌的三分之二。研究表明，使用靶向疗法，可以有效改善HR+/HER2-乳腺癌。但靶向药物和不同生物标志物的生物学相关性仍然不确定。

                                                                                                                                              图片来源于网络，侵删

　　对乳腺肿瘤的分子特征挖掘能够促进临床治疗策略的改善。在临床试验中，也进一步验证了基于乳腺癌亚型的靶向治疗的好处。目前，HR+/HER2-乳腺癌的临床实践中已使用了几种分子模型，但是现有的临床分期系统或预后模型不能准确反映生物学行为。为了解决这个问题，作者采用DNA和RNA测序，结合代谢组学和蛋白质组学，专注于开发一种反映HR+/HER2-乳腺癌异质性的生物学特征。此外，作者还通过深度学习开发了卷积神经网络(convolutional neural network, CNN)模型，帮助从病理全图像中推断出乳腺癌亚型。

　　技术路线

　　为了进行多组学亚型分析，作者建立了包含579名患者的中国HR+/HER2?乳腺癌大规模多组学队列。随后，研究了每种亚型的分子特征，并确定了每种亚型特有的治疗方法。同时还设计了一种基于人工智能的临床适用方法来推断每种亚型。

　　结果与分析

　　1 HR+ /HER2? 乳腺癌的综合分析

　　通过不同维度，使用相似性网络融合(Similarity Network Fusion, SNF)(将多组学数据整合起来，优化可视化结果的一种方法，是一种确定癌症亚型的有效聚类方法)对351名具有重叠数据集的患者进行多组学聚类，数据表明SNF聚类分析的聚类数为4，即SNF1-4(经典腔面型SNF1, 免疫调节型SNF2, 增值型SNF3, RTK驱动型SNF4。

　　SNF1和SNF3肿瘤几乎完全由PAM50 luminal A/PAM50 luminal B亚型组成。SNF1 中超过一半(51%)的肿瘤具有PIK3CA突变，而较少(11%)的肿瘤具有TP53突变。SNF3肿瘤则表现出更高的CCND1、FGFR1和MDM2拷贝数增益频率以及更多的细胞周期通路激活。在SNF3肿瘤中也观察到同源重组修回缺陷(homologous recombination deficiency, HRD)，表明基因组的高度不稳定性。

　　SNF2和SNF4肿瘤含有较少的PAM50 luminal A/PAM50 luminal B亚型和较少的激素受体途径激活。SNF2 显示出丰富的适应性免疫反应途径。对于SNF4肿瘤，与受体蛋白激酶和细胞外基质结构成分相关的表达特征高度丰富。

　　2 HR+ /HER2? 乳腺癌的代谢组学分析

　　作者应用欧式距离来分析SNF亚型及其相应正常组织内代谢表达的整体差异。发现SNF3亚型相比其他亚型代谢失调程度高，而SNF4是代谢失调程度低的亚型。这也进一步确定不同亚型肿瘤内的代谢组学特征。

　　随后通过构建网络模型来探索不同亚型肿瘤中的差异代谢基因、极性代谢物和脂质，并说明不同亚型之间的代谢特征。结果显示大多数失调通路在SNF3亚型中上调，但在SNF4亚型中下调。此外，SNF1和SNF2亚型以磷脂代谢为特征，并鉴定出参与磷脂合成的基因(例如PIP5K1A15和PIK3CG16)的高表达。

　　3 四种SNF 亚型的独特临床特征

　　作者进一步分析了临床病理特征。通过免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)染色测量，SNF3肿瘤具有较高的Ki67指数(在临床应用中，反映Ki-67核蛋白表达水平的指标称为Ki-67指数。Ki-67指数是指所有肿瘤细胞中免疫组织化学核染阳性的百分率。)和肿瘤分级，而SNF2肿瘤具有较低的ER表达。SNF亚型之间的HER2状态没有差异。另外，SNF4的无转移生存率(P?=?0.0021)和无复发生存率(P?=?0.00093)相比于其他三种亚型较差。特别是对于PAM50 luminal A的患者，SNF4的预后远不如其他亚型。单变量和多变量Cox(proportional hazards model)分析的应用明确证实了SNF4亚型是一个独立的预后指标。总之，作者将HR+/HER2肿瘤重新分类为四种亚型，每种亚型都具有不同的临床病理和多组学特征。

　　4 临床适用的SNF亚型分类方法

　　为了系统的推断亚型分类，作者使用了两种分类器，一种基于数字病理学数据，另一种基于转录组学数据。

　　对于基于数字病理学的方法，作者使用了243名患者的全切片图像以及多组学SNF亚型结果，采用基于深度学习的流程来开发CNN模型来识别四种亚型中的每一种。结果显示，ROC曲线下方的面积大小(Area Under Curve, AUC)SNF1亚型为0.87，SNF2亚型为0.81，SNF3亚型为0.78，SNF4亚型为0.78。基于我们开发的模型，指示每种SNF亚型的图块的形态特征可总结如下：SNF1部分保留正常乳腺的形态;SNF2高免疫细胞浸润;SNF3高丰度的非典型肿瘤细胞;SNF4肿瘤细胞簇与周围成纤维细胞的富集。总体而言，这些结果揭示了 SNF 亚型之间病理模式的差异，并表明基于数字病理学区分SNF亚型的可行性。

　　对于基于转录组学数据的方法，作者根据每个SNF亚型高表达基因的数据开发了一个随机森林分类器。在数字病理学模型的开发中使用了相同的交叉验证队列。结果显示：SNF1亚型的AUC为0.95，SNF2亚型为0.93，SNF3亚型为0.85，SNF4亚型为 0.82，高于CNN模型。

　　5 SNF3 亚型细胞周期途径的上调

　　通过基因组分析，作者发现SNF3样本中某些细胞周期基因的拷贝数变异(copy number alteration, CAN)频率整体增加。然后分析这些CNA与RNA或蛋白质表达之间的关联。观察到CCND1等癌基因的RNA和蛋白质表达大幅增加，而RB1等肿瘤抑制基因的表达减少，表明SNF3基因组改变驱动细胞周期信号顺式激活。

　　通过G2/M的两种调节因子，也观察到SNF3中细胞周期信号传导的顺式调节(cis-regulation)。此外，HRD和染色体不稳定性(chromosome instability, CIN)评分在SNF3肿瘤中更高。由于高HRD评分与对DNA修复酶抑制剂(poly ADP-ribose polymerase, PARP)的敏感性相关，作者观察到来自SNF3肿瘤的患者的类器官的生长被单一药物抑制，并被阿贝昔单抗和奥拉帕尼的组合进一步抑制。这些结果表明，SNF3亚型富集用于激活G1/S和G2/M细胞周期进程。

　　6 HR+ /HER2? 乳腺癌的微环境景观

　　肿瘤微环境(The tumor microenvironment, TME)参与肿瘤的发展。因此，作者对四种SNF亚型的微环境特征进行了综合分析。通过使用CIBERSORT(利用线性支持向量回归的原理对免疫细胞亚型的表达矩阵进行去卷积，来估计免疫细胞的丰度)和微环境细胞群计数器的单样本基因富集分析(Gene Set EnrichmentAnalysis, GSEA)评估，SNF2肿瘤中免疫细胞群的丰度显着增加，特别是适应性免疫系统的细胞。

　　随后通过scRNA-seq进一步分析了SNF2和SNF4肿瘤的TME特征。总共分析了来自9个肿瘤的69,479个细胞，并鉴定了11个不同的簇。观察到 SNF2 样本中 CD8+T细胞的比例较高(，而SNF4样本中癌症相关成纤维细胞(cancer associated fibroblast, CAF)的比例较高，这验证了批量 RNA-seq 数据的反卷积结果。

　　另外还发现，在接受抗程序性死亡配体1(PD-L1)抑制剂治疗的手臂中，大多数SNF2样本(93%)实现了病理学完全缓解。总体而言，全面剖析了SNF亚型之间的TME异质性，并表明SNF2肿瘤以免疫激活状态为特征，可能支持对这些肿瘤使用免疫检查点阻断。

　　7 SNF4 亚型衍生的 CAF 增强肿瘤生长

　　通过RNA-seq、scRNA-seq和磷酸化蛋白质组学的综合分析，作者观察到两种SNF4高表达的RTK主要在CAF中表达并且高度磷酸化。。通过蛋白质印迹，验证了PDGFRA和EGFR在SNF4肿瘤样本中高表达和高磷酸化，特别是在SNF4衍生的CAF中。

　　此外，作者还观察到来自SNF4衍生的CAF的条件培养基可以促进SNF1和SNF4衍生的癌细胞的增殖，表明CAF丰度可能是SNF1和SNF4衍生的癌细胞侵袭性的机制之一。

　　据报道，多RTK抑制剂索拉非尼可以有效靶向RAF–MAPK通路，从而抑制EGFR和PDGFRA的激活。通过癌症细胞和CAFs的共培养模型，作者进一步验证了索拉非尼治疗消除了由SNF4亚型衍生的CAFs共培养诱导的肿瘤生长表型。总之，CAFs中EGFR/PDGFRA的高表达和下游MAPK信号通路的激活可能有助于SNF4肿瘤的侵袭性，这也表明了SNF4患者的潜在治疗靶点。

　　总结

　　该研究基于大规模多组学队列，发现HR+/HER2?癌症在突变、拷贝数、转录、蛋白质组、代谢组和病理学特征方面存在差异。并且通过分析这些差异性，成功将所有HR+/HER2?群体分为四个亚型。最后针对每一个亚型的异质性，进一步提出了对应的精确治疗方法，为改善精准医疗在HR+/HER2?乳腺癌中的应用铺平道路。

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