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PI3K抑制剂综述和新的开发策略

发表时间:2020-06-28 16:21:00

  磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide3-kinase,PI3Ks)途径是人类癌症中最常被激活的信号通路之一,几乎介导50%的恶性肿瘤的发生。PI3K是一种胞内脂质磷酸激酶,催化肌醇第3位的磷酸化。PI3K是由一个催化亚基p110和一个调节亚基p85构成的异二聚体,具有SH2结构域(SrcHomology2domain)。通过SH2结构域,PI3K可与其它蛋白的磷酸化酪氨酸残基结合,从而被募集到质膜,使其催化亚基靠近质膜内小叶的磷脂酰肌醇。在膜脂代谢过程中,PI3K催化PI-4-P(PIP)生成PI-3,4-P2(PIP2),催化PI-4,5-P2(PIP2)生成PI-3,4,5-P3(PIP3)。这些与膜结合的PI-3-P为多种信号转导蛋白提供了锚定位点,进而介导多种下游信号通路。例如活化Akt/PKB、mTOR激酶等下游通路。


  根据PI3K的结构特点和底物分子可将其分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型3类。Ⅰ型分为IA型和IB型,IA型由受体酪氨酸激活,根据催化亚基p110的不同又可分为PI3Kα、PI3Kβ和PI3Kδ3个亚型;IB型即为PI3Kγ亚型。IA型PI3K与肿瘤的发生发展密切相关,其中编译PI3Kα的基因PIK3CA是肿瘤中最常见的突变,PIK3CA突变后在异常激活PI3Kα的同时,还能抑制抑癌基因PTEN的表达,因此PI3Kα成为抗癌药物研发中极为重要的靶点。


  目前,已有许多PI3K抑制剂批准上市或进入临床研究。泛PI3K抑制剂,如buparlisib、pictilisb(GDC-0941)、copanlisib等,泛PI3K抑制剂可以作用于所有I型的PI3K亚型,因此副作用与毒性较大,使得它们的临床进展缓慢。选择性作用于某个PI3K亚型的抑制剂具有更小的毒副作用,已有部分选择性PI3K抑制剂获批上市。Alpelisib是FDA批准的第一个PI3Kα抑制剂用于乳腺癌治疗,当Alpelisib靶向PI3Kα时,观察到此药可以有效地降低特定突变组合的信号强度。虽然该药被归类为PI3Kα特异性药物,但通常会观察到严重的浓度依赖性副作用和耐药性。主要原因是该药物和以前开发的药物一样,都是ATP竞争性的,而PI3K各亚型之间的ATP结合位点几乎相同,当给药浓度增加,不可避免地对其它亚型产生抑制作用。因此降低副作用,对PI3K抑制剂的开发与癌症治疗具有重要意义。


  本文作者RuthNussinov回顾了PI3K抑制剂,基于其课题组前期研究概述了PI3Kα激活的机制、致癌突变及其联合突变。最终提出了两种新的可能的PI3Kα抑制剂开发策略。(1)PI3Kα正构和别构抑制剂的联合使用;(2)开发挽救突变位点的别构抑制剂。


  PI3Kα的激活机制


  PI3K激活发生在质膜上,它是通过与RTK、RAS和膜上C-末端的磷酸化基序相互作用而介导的。如下图展示了突变位点导致PI3K激活的过程。


  受到KRas4B共价抑制剂开发过程的启发,可以尝试发现新的PI3Kα的别构口袋,来开发PI3Kα的别构抑制剂,在维持抑制活性的同时提高化合物对PI3K亚型的选择性。


  PI3Kα与Alpelisib的相互作用解析


  PI3K的ATP结合位点位于激酶结构域的两个片段之间,由铰链隔开。I型PI3K的ATP结合位点高度同源,仅在边缘处有几个残基不同。这些残基可分为分为两个区域,第一个是位于铰链附近的四个残基组成的可变区,第二个是位于P-loop处的较小的可变区。对于PI3Kα,铰链区可以提高ATP抑制剂的选择性。如图,Alpelisib结合激酶结构域中的ATP口袋,并与P-loop和铰链区相互作用。其中与Alpelisib接触的残基大多是保守的,只有铰链区五个可变残基(852RNSH855和Q859)。在这里,作者重点研究两个残基R852和Q859,因为其他三个残基(NSH)的侧链暴露于溶剂中,几乎不与Alpelisib的相互作用。PI3Kα的Q859与Alpelisib形成双氢键(图C),这表明并证实了其在亚型选择性中的重要性。此残基在PI3Kβ(D856)和PI3Kδ(N836)中变得更短,而PI3Kγ中的K890仍然足够长,足以与Alpelisib进行氢键相互作用。PI3Kα中的R852与激酶结构域N-lobe中的E798形成盐桥,在PI3Kγ(K831-E814)中观察到类似的盐桥。PI3Kγ的L829还与M762和W760建立疏水相互作用。而PI3Kβ中S849由于较短,则完全没有类似的相互作用。


  这些结果表明,铰链区的结构与Alpelisib对PI3K的选择性有关。PI3Kα(~5nM)的IC50值最高,其次是PI3Kγ(~250nM),PI3Kδ(~290nM)和PI3Kβ(~1200nM)。虽然,利用铰链区残基的差异设计高选择性的PI3K抑制剂取得一定进展,但是仍存在一些缺点。例如,人体中部分PIP2脂质以高亲和力锚定在细胞膜中,因此底物结合位点较浅,深埋于细胞膜的蛋白质表面进一步限制了小分子的进入。


  这使得模拟ATP结构,作用于铰链区的小分子抑制剂往往需要较高的给药浓度,随之而来的是脱靶效应带来的毒副作用。因此,寻找其它空腔并开发相应的抑制剂具有重要意义。


  目前,一个非ATP类型的别构口袋已经被发现(PDB:4A55),然而该口袋尚不清楚其具体功能,作者认为该结合位点不太可能产生有效的别构抑制剂。基于片段的筛选,作者鉴定在E542K和E545K突变热点处具有磷酸肽结合作用的别构抑制剂口袋,并获得了满意的结果。这些变构口袋总结在上面图A和B中。此外,如上图C部分,在ABD和激酶结构域的N-lobe之间有一个口袋,该口袋较深,疏水性强,涉及的残基包括ABD–RBD接头中的115–123号残基,以及激酶域的N-lobe中的699–715号残基和840–845号残基。靶向此口袋的抑制剂有望增强ABD和iSH2的的结合界面,从而稳定了PI3Kα的失活构象。


  开发PI3Kα抑制剂的新策略


  1、别构抑制剂联合正构抑制剂


  曾经,人们发现:转移性间变性淋巴瘤激酶(ALK)的Cys至Tyr突变(C1156Y)使它对ATP竞争的药物克唑替尼耐药。之后的Lorlatinib也由于L1198F的突变,导致了耐药性。然而,明显的L1198F变构突变却使ALK对克唑替尼重新敏感,携带这种突变的患者再次接受克唑替尼治疗,癌症相关的症状得到缓解。这里,L1198F就是挽救性突变,该突变重新分布了ALK构象集合,促进克唑替尼的结合状态。因此,一旦发生挽救性突变,就不需要相应的别构抑制剂。如果在该位置没有这种突变,则可以模拟开发相应的别构抑制剂,从而促进ATP结合位点上的可容纳药物的构象变化。因此,别构药物可以像别构突变一样重新激活活性位点,从而恢复正构药物的作用。


  别构药物与正构药物联合使用的概念并不新鲜,但在PI3Kα中尚未经过测试。别构药物通过改变构象封堵ATP竞争抑制剂,使正构抑制剂结合的更加稳定。或通过产生可成药的PIP2结合位点来克服PI3Kα耐药性。


  2、挽救性突变位点抑制剂的开发


  如何确定此类突变的位置?早些时候作者研究vonHippel–Lindau肿瘤抑制蛋白(pVHL)的过程中,他们使用了分子动力学模拟,寻找蛋白质未结合状态中最不稳定的区域来确定可能的候选残基,这些残基减弱了两个结构域之间的连接,同时,在域间界面和域中设计了几个稳定性的突变。结果表明,在缺氧诱导因子(HIF)结合位点的疾病突变体Y98N破坏了pVHL的稳定性,并降低了其对HIF的亲和力,模拟表明pVHL的稳定性和结合力是别构调节的。因此,可以寻找稳定pVHL而远离结合位点的别构突变口袋。基于蠕虫的pVHL,作者通过设计取代片段来稳定Y98N突变体,降低了pVHL与HIF的复合物的结合能,以此稳定了pVHL,从而拯救了pVHL–HIF的亲和力和功能。


  同样的,在PI3Kα中,挽救突变可以通过别构位点控制改变构象,从而在不增加其浓度的情况下提高ATP竞争药物对其结合位点的亲和力。激酶结构域的P-loop的突变位点可能是有希望的靶点。对于PTEN肿瘤抑制剂,也可以考虑采用这种策略。


  此外设计别构抑制剂的关键还包括识别变构位点,包括隐性别构口袋。别构抑制剂可以形象的描述为“锚”和“驱动”的双重作用。锚固定在一个别构口袋中,使PI3Kα在非性状态和活性状态之间的转换过程中构象保持不变,驱动程序则“拉动”或“推动”蛋白质原子(侧链或主链)并使受体进入药物结合状态。


  总结


  PI3K是癌症药物开发的热门靶点,发展至今已有许多PI3K抑制剂上市或进入临床研究阶段。泛PI3K抑制剂由于对亚型选择性较差,往往具有较大的毒副作用;选择性PI3K抑制剂虽然在体外活性测试中有较好的亚型特异性,但是在体内仍然无法实现有效的选择性,使临床收益降低。本文主要介绍了与癌症密切相关的PI3Kα,分析了其结构特征与自抑制构象,简要介绍可能实现选择性抑制作用的别构口袋,为PI3K抑制剂的研究提供了新的思路。


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