基于类器官的高通量RNA测序有助于寻找治疗结直肠癌的药物

　　大肠癌(CRC)是当今世界上确诊率最高的3种癌症之一，也是与癌症相关的发病率和死亡率的主要原因之一。尽管近年来癌症疗法在不断地发展，但针对晚期和转移性肠癌患者仍然缺乏有效的治疗方法，因此迫切需要基于药物的新型疗法。

　　(图片来源：www.cell.com)

　　在最近一项研究中，来自瑞士肠癌研究所的Joerg Huelsken团队开发了基于类器官的高通量筛选系统“TORNADO-seq”，用于鉴定能够诱导肠道正常细胞和癌细胞分化的小分子药物。具体而言，该方法通过定量大量细胞类型特异性基因的RNA表达分析，然后通过反卷积方法推断细胞类型组成，最终实现研究目的。作为一种高含量技术，mRNA表达分析与其他方法(例如基于抗体或报告基因的方法)相比，具有许多优势，例如精确度，可扩展性和敏感性。

　　该方法不仅可以发现药物，还可以进一步揭示内在的生物学机制。作者开发的高含量检测方法通过测量基因表达谱，从而提供所有可能的肠道细胞表型，主要信号通路和一般细胞生理学的频率的信息，从而检测健康肠道或癌变肠道来源的类器官中206个基因的表达水平。

　　(图1，肠道类器官分化以及RNA-seq分析流程建立示意图)

　　为了覆盖不同的肠道细胞表型，作者选择了8个种群的标记基因：ISC，瞬时扩增(TA)细胞，吸收性肠上皮细胞(E)，EEC，杯状细胞，Paneth细胞(P)，簇细胞和静态ISC(qISC)。这些标记基因是从公开的数据库(原肠细胞悬液和类器官培养物的RNA-seq和单细胞RNA-seq)中挑选得到的。通过进一步富集，荧光激活细胞分选(FACS)或体外分化方案，作者另外囊括了58个报告主要信号通路的基因(Notch，Wnt，Hedgehog，Hippo， BMP / TGF-b]，NF-kB等)，27种一般细胞生理基因(包括细胞周期，新陈代谢，血管生成，凋亡，上皮间质转化等)，以及6个持家基因。

　　进一步，作者筛选了能够促进健康肠道类器官中细胞分化的药物分子。结果显示，在中靶率排名靠前的药物中包括：1. 已经用于治疗结肠癌的分子——伊曲康唑，吡咯铵，2. 微管蛋白抑制剂(苯达唑，秋水仙碱)，3. 已知会影响一般细胞生理的细胞毒性药物(抗代谢物吉西他滨，氮杂鸟嘌呤，巯基嘌呤，氟尿苷 拓扑异构酶抑制剂，4. 细胞毒性抗生素(蒽环类抗生素和抗霉素)。 此外，筛查程序还发现了几种候选药物，例如抗精神病药物吩噻嗪，降胆固醇他汀类药物，抗真菌药康唑，选择性雌激素受体调节剂(SERM)，糖皮质激素和抗组胺药等等。

　　(图2，不同药物对健康肠道类器官中细胞分化相关基因表达水平的影响)

　　之后，作者比较了不同药物对健康肠道类器官以及癌变肠道类器官的细胞分化影响。结果显示，在27个能够引起健康肠道细胞分化的药物中，有16个同样能够引发癌变肠道细胞的分化(干细胞相关标志物表达水平下降，伴随着分化相关标志物的上升)，而大量对健康肠道细胞分化无效的药物分子同样也对癌变肠道细胞分化无效。这一结果表明药物的有效性与其影响细胞分化的能力之间存在必然联系。

　　综上，作者通过开发靶向类器官测序(TORNADO-seq)技术，高通量地监控主流“基因标志物”的表达，以详细评估类器官中的细胞表型。 TORNADO-seq作为一种快速，稳定性高以及成本低廉的(每个样品5美元)的方法，可检测细胞混合物及其在肠道系统中的分化状态。应用此方法，作者寻找到了促进分化细胞表型的药物，并表明这些药物对癌症具有很高的疗效。此外，TORNADO-seq有助于深入了解这些药物的作用方式。该技术可以轻松地适应许多其他系统，并允许采用更系统，大规模和定量的方法来研究复杂细胞系统的生物学特性。(生物谷 Bioon.com)