来自TILs

　　肿瘤通常是由T细胞渗润，T细胞的一部分与各种肿瘤抗原发生反应。这些抗原包括组织分化抗原、癌胚抗原、与转化肿瘤病毒相关的抗原和突变衍生的新抗原。因此，肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)可以作为TCR基因序列的来源，赋予抗肿瘤免疫。尽管富含肿瘤反应性T细胞，但仅凭TCR频率通常不足以预测肿瘤的反应性。这是因为大多数TIL是被动的旁观者，对病毒或其他病原体具有特异性。因此，已经开发出识别和分离肿瘤特异性TIL的策略，这些TIL分为三类：表型、功能和转录。

                                                                                                                                               图片来源于网络，侵删

　　表型marker是结构性表达的膜相关蛋白，使其易于测定，便于大规模分离使用。表型marker的检测是通过使用FACS分选分析或分子条形码抗体，然后通过测序(CITE-seq)对转录本和表位进行细胞索引来完成的。ATPase CD39的表达、组织驻留标志物CD103或PD1、LAG3和TIM3(也称为HAVCR2)识别肿瘤反应性TIL。在CD4+TILs的情况下，具有调节性T细胞表型的细胞可以作为TCR序列的额外来源，该TCR序列赋予对HLA II类限制性肿瘤抗原的反应性。

　　功能marker可以直接评估TIL的抗原特异性，也可以测量TCR聚集引起的表面marker表达的变化。虽然在技术上比表型marker评估更具挑战性，但功能marker能够以更高的特异性富集肿瘤反应性TIL。对肿瘤抗原具有特异性的TCR可以通过与负载肿瘤相关多肽的HLA多聚体结合来识别。利用FACS分选或磁珠分离，荧光偶联的p/HLA多聚体可促进抗原特异性TIL的分选。然而，这种方法需要大量的起始数量，并且同时筛选多个抗原特异性的能力有限。使用DNA-barcoded p/HLA多聚体结合单细胞测序的CITE-seq，能够以较小的样本量高通量筛选和检索与抗原相关的TCR序列。或者，来自未知特异性的TIL的TCR克隆型的特异性可以使用酵母展示或抗原提呈细胞(APC)展示高度多样化的p/HLA文库去选择。尽管这些方法中的每一种都有实用价值，但实践的局限性限制了一次可以筛查的HLA、表位和多肽长度的总数。肿瘤坏死因子受体超家族的两个成员4-1BB(也称为TNFRSF9和CD137)和OX40(也称为TNFRSF4和CD134)在静息T细胞上不表达，但在抗原刺激后表达上调。与细胞因子的表达不同，4-1BB和OX40的表达依赖于TCR的连接，并且与T细胞分化无关。因此，基于这两个marker的表达的TIL选择可以作为一种功能策略来检索肿瘤反应性TCR，而不需要事先知道它们识别的表位。

　　最后，单细胞转录组特征可以在体外直接鉴定肿瘤反应性TCR克隆型，而不需要扩增或功能测试。趋化因子CXCL13的表达和多种衰竭相关基因，包括ENTPD1(编码CD39)，PDCD1(编码PD1)，HAVCR2和TIGIT，在肿瘤特异性T细胞中高于旁观者T细胞【注：这里的更多相关细节可阅读《快速实现个体化TCR-T细胞治疗》和《抗肿瘤新抗原反应性T细胞的分子特征》】。相比之下，旁观者T细胞通常表达高水平的记忆相关基因，如IL7R和TCF7。

　　来自患者的循环T细胞

　　在循环T细胞中可以发现由TIL表达的TCR克隆型，尽管频率明显较低。因此，外周血可以作为肿瘤反应性T细胞的来源。在选定的病例中，对肿瘤抗原具有特异性并已进行克隆性扩增的T细胞可使用p/HLA多聚体在体外直接检测到。更常见的是，需要富集稀有TCR克隆型的策略。共抑制分子PD1和T细胞记忆标记CD45RO鉴定含有抗肿瘤T细胞的循环人群。然而，由于肿瘤反应性T细胞只占这些池的小部分，因此需要进行体外T细胞扩增以进行反应性筛选和TCR测序。这可以通过使用单核细胞来源的DC细胞的肿瘤相关多肽脉冲或编码肿瘤抗原的RNA电穿孔的体外刺激(IVS)实现。

　　如果已知肿瘤抗原的多肽序列和HLA限制性，就可以使用合成的p/HLA复合体直接分离抗原特异的T细胞。p/HLA复合体与荧光染料、Strep-tag II序列或顺磁性人工APC的结合允许稀有T细胞群的富集和扩增。或者，可在体外直接捕获肿瘤反应性T细胞，并使用显示p/HLA多聚体的DNA-barcoded纳米磁珠一步检索其相应的TCR序列。

　　来自健康捐赠者

　　在肿瘤患者中，相当大比例的HLA提呈的多肽不能激发T细胞反应。这可能是因为无效的启动或因为先前的癌症治疗路线对肿瘤反应性T细胞适应性产生负面影响而发生的。为了克服这些限制，TCR的发现可以使用健康donor的幼稚T细胞来“outsourced”。这种方法中，在使用APC进行IVS之前，分离初始T细胞以最大限度地增加TCR谱的多样性。APC可以用多肽脉冲，或用编码肿瘤抗原的mRNA转染以加强更多需要蛋白降解和内源性HLA负载的生理性抗原呈递。或者，可以在没有预先IVS的情况下使用p/HLA多聚体富集和单细胞分选直接分离抗原特异性初始T细胞。筛查多名健康donor增加检测到T细胞反应的可能性，并增加产生的T细胞克隆型的多样性。在TAA抗原中，其中表达由癌细胞和正常组织共享，HLA不匹配的donor可能被用作检索高亲和力TCR序列的策略，这是因为对同种异体HLA起反应的T细胞谱不受胸腺阴性选择的影响。然而，由于从不匹配的donor中提取的TCR可能表现出与通用同种异体HLA的混杂，因此在临床测试之前需要对潜在的off-target反应进行系统筛查。

　　来自HLA转基因小鼠

　　表达HLA分子并已用人类肿瘤抗原免疫的转基因(Tg)小鼠可用作TCR的来源。这种方法有几个优点，首先，它利用小鼠和人类蛋白质序列的差异作为一种策略，以克服胸腺选择对靶向自身抗原的TCR池的负面影响;其次，由于啮齿动物相对容易免疫，因此HLA Tg小鼠是一种产生不同TCR的时间和成本效益高的方法。从免疫的HLA Tg小鼠中提取的T细胞克隆的可变序列已被用作多个临床试验的TCRs的来源。在接受从HLA Tg小鼠获得的TCRs的患者中，靶向抗肿瘤免疫的证据证实了这种方法的治疗潜力。然而，以这种方式来源的TCR的一个主要限制是，受体的小鼠可变序列可以包含免疫原性表位。

　　来自人源化小鼠

　　为了克服使用具有小鼠可变序列的TCR的局限性，已经产生表达完整的人TCRαβ基因组位点但缺乏小鼠TCR序列的Tg小鼠品系。从概念上讲，这种方法建立在先前的工作基础上，这些工作证明用人免疫球蛋白VH/VL基因座改造的转基因小鼠可以作为完全人抗体序列的来源。将TCR人源化小鼠与HLA Tg小鼠杂交，可以对不同的人类TCR谱系进行采样，这些谱系是受HLA限制的。用肿瘤抗原基因免疫TCR人源化小鼠，使TCR候选动物具有完全的人可变序列。在某些情况下，从人源化小鼠克隆的TCRs显示出比人源性TCRs更高的功能亲和力。

　　On-target/off-tumor毒性风险

　　当肿瘤细胞和正常组织共同表达相同的p/HLA复合物时，预计会出现on-traget/off-tumor毒性。因此，TCR疗法候选药物的毒性风险缓解始于严格评估健康细胞的抗原表达。在由体细胞突变和转化肿瘤病毒产生的表位的情况下，off-tumor毒性风险被降至低，因为正常组织不表达这些蛋白质。对于其他抗原类别，可以使用公开可用的转录组和蛋白质组数据库进行表达的初步评估。RNA-seq具有高敏感性、高特异性和大的动态范围。RNA-seq数据库，例如GTEx，提供了来自多个正常组织的高质量测序结果。人类单细胞RNA表达图谱通过促进稀有细胞种群的识别来补充大量的RNA-seq数据。因为基因和蛋白质表达之间的相关性是不完善的，仅在关键组织中可检测到的RNA转录本不足以断定候选抗原是否代表不安全的靶点。因此，蛋白质水平的表达分析是可取的验证步骤。最后，重要的是要考虑到选定的组织的影响，如睾丸不表达HLA分子，因此不被T细胞直接识别。

　　评估交叉反应

　　TCR还可以调节由任何单个TCR的退化潜力引起的off-target。TCR的安全性不是由其潜在结合的多肽序列的绝对数量决定的，而是由TCR结合多肽的能力决定的，这些多肽是由off-target的蛋白在HLA中的内源性加工和表达所产生的。只有在执行关键功能的健康组织表达off-target蛋白的情况下，才会导致不可接受的毒性。实验动物和人之间蛋白质序列的差异，加上缺乏HLA的表达，限制了体内毒理学研究在评估on-target和off-target TCR毒性风险方面的有效性。因此，通常需要体外策略来量化候选TCR的退化潜力和安全性。应该进行哪些分析以及在什么情况下评估交叉反应仍然是该领域的一个悬而未决的问题。下面，概述几种用于支持TCR研究新药应用的技术，以及可能有助于降低未来候选药物风险的不断发展的技术。

　　当TCR表现出与胸腺发育过程中没有遇到的HLA的交叉反应时，就会发生同种异体反应。使用一组表达流行HLA但缺乏靶抗原的HLA不匹配细胞系可以确定TCR是否具有同种异体反应性。如果TCR不显示同种异体反应性，应使用其他方法来评估TCR对表达限制性HLA但被其他自身肽结合的靶点的特异性。这可以通过从HLA匹配的健康donor获得的一组正常细胞中筛选候选的TCR来实现。然而，即使是大panels也可能无法包括高度专一化或稀有的细胞类型。提高心脏或肾脏等重要器官细胞亚群的代表性的一种策略是使用诱导多能干细胞或正常组织器官。

　　一种确定TCR交叉反应潜力的补充技术，称为氨基酸位置扫描，首先确定哪些肽残基与受体形成关键接触。这种方法中，同源肽中的每个氨基酸都依次被小的手性氨基酸丙氨酸取代。在天然残基为丙氨酸的情况下，可以使用另一种紧凑氨基酸，如甘氨酸。TCR的识别基序是由氨基酸取代导致与天然氨基酸相比丧失功能(通常>50%)的多肽位置定义的。氨基酸扫描的临床应用被证明是由于针对MAGE-A3蛋白中的一个表位而导致的亲和力增强的TCR引起的致命性心脏毒性的原因，该多肽来自心脏结构蛋白Titin。位置扫描可以扩展到包括所有20种标准氨基酸，以测量TCR对含有化学相似残基的肽的透过性。一旦确定了TCR的识别基序，这些数据就被用来进行计算机搜索，以确定人类蛋白质组中其他地方是否存在同源基序。

　　虽然位置扫描提供了哪些肽位置有助于TCR识别的有用信息，但该技术可能会遗漏重要的交叉反应。例如，一些肽序列作为有效的激动剂发挥作用，但与TCR识别的天然肽显示出极小的同源性。这可能是肽内偶联的结果，通过对肽中心核心外残基的修饰促进新的TCR接触的产生。组合多肽文库具有很高的多样性(通常是10^8到>10^11个变体)，并且包含的多肽中一个氨基酸位置是顺序固定的，而其余的位置被所有20个氨基酸取代。组合多肽文库在识别多肽靶标方面显示出前景，特别是当与生物信息数据库筛选相结合时。或者，酵母展示、噬菌体展示和分子条形码人工APC可以提高交叉反应筛选的速度和灵敏度。在所有发现潜在交叉反应肽的情况下，需要进行额外的研究以确定其生理意义。

　　评估效力

　　将TCRs用于临床开发的低限度的效力衡量标准是识别由内源性加工和蛋白质呈递产生的多肽的能力。对于HLA I类限制性TCR，理想情况下应该辅之以确定全长蛋白和限制性元件的生理性表达水平是否足以识别。除了细胞因子的分泌，重要的是要比较不同的候选TCR引起肿瘤细胞裂解的能力。公共数据库可以识别共同表达靶抗原和限制性HLA的市售可用的肿瘤细胞系。然而，并不总是有可能确定表达一对感兴趣的p/HLA的已建立的细胞系。克服这一限制的一种解决方案是创建一个代表肿瘤受HLA限制的抗原性图景的“化身”。这可以使用串联迷你基因(TMG)或含有体细胞突变、基因融合、插入/缺失、整合病毒或CGAs的合成长肽来完成。将TMG或合成的长肽脉冲作用于自体APC，可加强患者补充的HLA对抗原的处理和呈递。最近，病人来源的肿瘤类器官被用来对癌细胞表面展示的天然处理的多肽进行采样。相对于已建立的癌细胞系，肿瘤类器官中更接近人类肿瘤的基因组异质性、表型和三维特征。此外，与患者来源的异种移植物不同，可以平行建立正常组织器官，为评估off-target风险提供了一种补充方法，尽管有这些优点，但类器官的生产既耗时又昂贵。从CD4+T细胞中提取的TCR的特征带来了额外的挑战，因为许多实体癌缺乏稳定的HLA II类表达。这一障碍可以通过外源表达II类MHC反式激活因子(CIITA)来克服，CIITA是HLA II类表达的主要转录调节因子。

　　功能亲和力，即T细胞对逐渐降低的同源多肽浓度作出反应的能力，是比较不同TCR的一种常用且技术简单的方法。一般来说，功能亲和力与肿瘤细胞识别的程度相关。然而，功能亲和力的测量受到多种因素的影响，这些因素与TCR的内在特性无关，包括T细胞分化和活化历史。此外，不同的抗原阈值触发不同的T细胞功能(如细胞因子产生和细胞增殖)。因此，非常需要定量、可重复的和不依赖于T细胞状态的评估TCR效力的替代测定方法。

　　结合亲和力，单个TCR分子与单个p/HLA复合物相互作用的强度，通常由解离平衡常数Kd表示。在临床前模型和临床试验中，天然产生的TCR的结合亲和力与抗肿瘤疗效相关。在平衡条件下，Kd由解离速率和缔合速率之比(koff/kon)定义。大多数胸腺选择的TCR Kd值在1-200μM范围内;然而，定向进化技术可以产生具有pM结合亲和力的TCR。结合自身抗原的TCR通常具有较高(较弱)生理范围的Kd值，可能是由于胸腺的阴性选择。相比之下，靶向突变衍生新抗原的TCR往往具有较低(较强)的Kd值，其范围与病原体相关受体重叠。Kd值通常使用SPR来测量，其中重组单链可溶性TCR流过含有固定的p/HLA复合物的传感芯片(反之亦然)。结合亲和力与TCR功能反应有不同程度的相关性。然而，这种相关性并不是普遍适用的。在极端情况下，两个TCR可以以接近相等的Kd值结合相同的p/HLA复合物，但显示出不同的信号反应(例如，一个受体可能触发T细胞激活，而另一个不会)。在某些情况下，TCR的三维结合亲和力与其信号传递能力的解偶联被归因于SPR无法解释力依赖性相互作用，例如捕获键的形成。二维方法直接测量活T细胞上TCR的亲和力和/或结合动力学，而不需要重组TCR的表达和纯化。尽管二维亲和力与生物学结果的相关性更密切，但这项技术的通量仍然相对较低，需要专门的仪器。

　　为了实现更快的通量，基于流式细胞术的方法已经发展起来，既可以推断TCR亲和力，也可以直接测量活T细胞上单体TCR-p/HLA复合物的解离动力学。T细胞依赖CD8共受体激活的程度与TCR的亲和力及其与p/HLA分子的解离半衰期成反比。因此，结合p/HLA多聚体或以共受体非依赖性方式触发抗原特异性效应功能的TCR定性地暗示该受体可能具有相对高的亲和力。基于流式细胞术的定量测量是结构亲和性，即单个膜相关TCR与单体p/HLA分子结合的能力。与功能亲和力不同，结构亲和力测量与T细胞分化状态无关，因此表明T细胞克隆和TCR-T细胞之间高度一致。在方法学上，结构亲和力使用p/HLA多聚体来测量TCR-p/HLA解离速率(koff)，这些多聚体在添加惰性化合物后解离成单体。与koff速率较快的TCR相比，表达koff速率较慢的TCR的T细胞过继细胞转移(ACT)提供了更好的抗肿瘤效果。

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