ctDNA在结直肠癌中的应用价值和质量控制

　　春至花开，白衣归来

　　2020年伊始，突如其来的新型冠状病毒肺炎蔓延全国，挑起了一场没有硝烟的战疫。我们隔离病毒但不隔离学术，我们相信寒冬已尽，花开可期，就让我们用学术专业与精准诊疗，和患者共迎春暖花开，美好生活。

　　课程信息：

　　讲者：中国医学科学院肿瘤医院李文斌教授

　　题目：《ctDNA在结直肠癌中的应用价值和质量控制》

　　随着精准医学的发展，如何使肿瘤患者得到更精准的治疗一直以来都受到广泛关注。多数肿瘤患者会面对组织取材困难的问题，因此，相较于组织检测更便捷、可行性更高的血液检测快速发展。中国医学科学院肿瘤医院李文斌教授主要从血液检测概述、血液检测平台介绍、肠癌ctDNA研究进展和ctDNA检测质控四个部分对ctDNA在结直肠癌中的应用价值和质量控制内容进行分享。

　　ctDNA检测概述

　　过去只在基线和二次活检时进行分子检测，指导肿瘤靶向治疗。ctDNA的出现使得肿瘤靶向治疗从单一时间点检测到时空检测，从而可以在治疗前、治疗中、初始治疗后等多阶段动态检测，进行靶向人群筛选、治疗疗效监测、治疗药物再选择以及预后评估等。

　　ctDNA是cfDNA中含有肿瘤信息的DNA，大小约为150bp。由于血液中ctDNA具有浓度低、片段化、被大量未突变的cfDNA所稀释等特征，使其在实际检测中仍面临一些困难。

　　目前血液ctDNA检测检出率最高的基因变异类型是单碱基突变（点突变），这对于主要突变为KRASpG12X和BRAFV600E点突变的肠癌患者来说无疑是比较幸运的。约有一半数量的结直肠癌患者有RAS基因突变，通过对结直肠癌中RAS基因ctDNA的动态监测可以指导患者进行治疗用药选择。

　　血液检测理论基础是基于肿瘤异质性及克隆进化，ctDNA液体活检具有可以从时间和空间进化对肿瘤突变进行全面评估的优势，因此可以帮助有效指导肿瘤治疗。

　　检测平台介绍

　　我们知道，对于ctDNA的检测有NGS测序、数字PCR、ARMS-PCR、BEAMing等，不同平台检测灵敏度亦不相同，可以根据肿瘤患者疾病不同阶段的需求，选择适合的检测技术。目前ctDNA的应用主要是针对晚期肿瘤患者的靶向用药指导、疾病进展与耐药机制监控以及术后复发监控，在消化系统肿瘤中血液样本与组织样本检测的一致性较高。

　　肠癌ctDNA检测进展

　　我们已经看到了ctDNA对于肠癌患者的应用价值，那么在临床真实世界的应用中，ctDNA是否真的能提供有效的信息，并指导患者进一步治疗呢？经之前多项试验研究的结果证实，在初治患者中，ctDNA能为患者提供用药及预后信息的指导；在治疗过程中，ctDNA也能监测RAS基因、EGFR基因、MET基因、HER2基因等驱动突变的状态及全面突变信息，提供用药指导，发现潜在治疗靶点，为患者Rechallenge治疗提供更多选择。

　　ctDNA检测质控

　　正如组织NGS检测需要多环节质控一样，严格的质控标准在血液NGS检测中更加发挥至关重要的作用，可以影响测序结果准确性及其在临床中的指导意义。

　　虽然目前对于肠癌ctDNA检测尚未有专家共识，参考中国非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识可以看出，对于血液NGS检测的质控包括血液评估、ctDNA质量评估、预文库评估、文库评估、环境&测序仪状态、原始数据标准六大环节，涉及cfDNA质控、实验质控、数据分析质控等多个方面。各环节质控合格是保证NGS测序结果准确性的重要保证。

　　综上所述：

　　1、结直肠中RAS基因点突变是ctDNA检测的理想靶点；

　　2、肿瘤异质性和治疗过程中的克隆进化是ctDNA检测的理论基础；

　　3、临床研究证实肠癌ctDNA检测在初治患者中与组织检测一致性较高；

　　4、临床研究证实肠癌ctDNA检测在出现耐药患者的动态监测和靶向治疗药物再选择中具有优势；

　　5、ctDNA检测的质控与组织检测相比更为重要，任何检测都面临灵敏性与特异性的悖论，目前研究显示ctDNA检测特异性较高，如何提高灵敏度是下一步急需要做的；

　　6、另外，对于ctDNA检测与Rechallenge治疗时机选择、低丰度的ctDNA突变与疗效相关性研究、获得性亚克隆突变与疗效关系研究等方面仍亟待更多探索。

　　问答环节

　　最后，李文斌教授在线回答了网友提问。

　　Q1:ctDNA检测遇到临界丰度突变值和低丰且无法获取组织标本时，要怎样分析和利用结果？

　　李文斌教授：建议对组织检测和血液检测阳性率进行比较。肠癌以RAS基因突变为主，此类突变组织检测和血液检测的一致性较高。在实际指导临床的过程中，若能获得组织，还是以组织的检测结果为准，但对于很多晚期的肠癌患者，在无法获得组织的情况下，如果血液检测出现低丰，因为血液检查突变丰度本身较低，所以必须通过严格的ctDNA质控，确定结果阳性值的准确性。

　　Q2:目前有数据显示，RAS状态会随治疗发生变化，RAS突变患者在使用标准治疗，如抗VEGF后，会有部分患者转成RAS野生型，对这个问题如何看待？

　　李文斌教授：这种情况个人认为，也是源于肿瘤的异质性，并非所有肿瘤细胞都存在突变，而有突变的细胞在经过标准治疗方案后被清除。这是MDAnderson的专家分享的内容，并将这种RAS突变的清除定义为Neo-RAS，这为我们提供了非常好的方向。也证明了ctDNA动态监测的重要性。通过连续监测，可明确是经过治疗由突变型变为野生型，还是突变型细胞经过治疗后凋亡或死亡，使野生型占更大比例。这为临床治疗的决策提供了辅助，同时也对检测工作提出更高的要求。

　　Q3:刚刚提到的Neo-RAS，目前是否还没有被用于临床，会对临床具有怎样的价值呢？

　　李文斌教授：Neo-RAS概念的提出其实是和ctDNA检测技术相关的。既往仅可通过组织进行检测，无法确切了解肿瘤在治疗过程中，其内部或基因组发生了何种变化，而ctDNA检测为我们提供了手段。该结论源于国外一项在约200例患者中进行的研究，这也提示我们，在具备ctDNA检测技术的前提下，我国也可以进行相应研究，探讨是否存在这种基因突变的时空异质性，从而更好地指导临床。

　　Q4:血液检测ctDNA和患者的肿瘤负荷之间是否有联系呢？

　　李文斌教授：ctDNA来自已经凋亡或死亡的肿瘤细胞，肿瘤负荷较大理论上，释放的cfDNA越多，所检测到的有突变的ctDNA也就越多。因此，个人认为二者是相辅相成的。这也解释了早期肿瘤很难在血液中检出ctDNA，一方面由于肿瘤负荷太小；另一方面则是在局部微小病灶中，肿瘤所释放出的ctDNA很难进入到血液。

　　Q5:动态监测ctDNA会很大程度增加患者的经济负担吗？

　　李文斌教授：随着ctDNA检测技术的不断发展，其普及程度将也会逐渐加强，如成为医保的基本选项之一，这会降低患者的经济负担。另外，随着测序技术不断发展和测序成本的降低，其价格应该也会是广大患者可以承受的范围之内。

　　Q6:血液检测ctDNA在肠癌的免疫治疗中前景如何呢？如TMB的评估？

　　李文斌教授：首先，肠癌中如微卫星不稳定（MSI），虽然MSI-H患者免疫治疗效果非常好，但MSI-H患者在晚期肠癌中占比很少，这也限制了MSI作为最佳biomarker应用于肠癌治疗。

　　而TMB是非常有效的标志物，即肿瘤突变负荷越高，产生的新生抗原越多，免疫治疗效果越好。TMB的检测基本是全外显子或者大panel进行测序。并且除组织检测外，血液也可以检测TMB，我院王洁教授团队，发现在肺癌中血液TMB（bTMB）和组织TMB有非常好的相关性，同样可预测免疫治疗疗效。个人认为，血液检查对于TMB应是非常好的方向。

　　此外，现在随着对TMB理论研究的深入，发现很少的基因数量（如9个基因），就可以预测TMB。虽然相关结果尚未发表，但当可以用几个基因预测TMB时，无论是对血液检测还是组织检测，一方面降低了检测费用，另一方面提高了检测的重复性，检测周期也可极大缩短。目前对于TMB存在的问题还是解读方面。

　　Q7:对于肠癌是否有必要使用大panel的NGS进行评估，还是选择RT-PCR法，检测RAS基因即可？

　　李文斌教授：个人观点是，在肠癌中RAS基因是阴性选择药物，推荐进行KNB（K-RAS、N-RAS、BRAF）。除KNB三个基因激活会影响到肠癌抗EGFR疗效外，还有其他基因会引起旁路激活，影响抗EGFR的治疗效果，KNB的RT-PCR试剂盒检测同样可行，但随着高通量测序检测成本和费用的降低，仍建议在肠癌中进行panel检测。但根据当地情况，RT-PCR也可以满足临床诊治需求。

　　Q8:临床诊疗中，ctDNA可以全面发现突变信息，对于已发现的潜在靶点，但无临床靶向药物，有相关的汇总分析吗？

　　李文斌教授：中国医学科学院肿瘤医院在肠癌方面常规进行几十个基因的检测，很多尚无相应靶向药物获批的基因，但对临床研究是非常有价值和意义的，如APC基因、TP53基因、MET基因，HER2基因其实也都有检测。

　　Q9:基因层面新靶点的发现，如何转化成对临床更具价值的内容？在多学科讨论中病理科应担任什么样的角色或地位？

　　李文斌教授：随着分子病理的进展，所涉及到的如靶向治疗和免疫治疗，逐渐面向肿瘤基因层面。对病理科医生提出了更高的要求，病理科医生也理应在MDT中扮演更重要的角色。

　　分子病理是连接基础研究和临床治疗的桥梁，有很多年轻医生从事分子病理的行业，也掌握了很多先进的知识，因此，未来病理科不应只局限于检测结果的统计，而应在保证检测结果准确性的同时，更多可以进行转化医学研究。积极参与、深入多学科进行相关基础研究的合作，形成病理科在疾病诊疗方面的见解。

　　文章来自中国医学论坛报今日肿瘤