曙光乍现—KRAS G12C明星抑制剂的进击之路

　　RAS癌基因突变是人类癌症中最常见的激活突变，发生在30%的人类肿瘤中。尽管是最早发现的癌基因之一，但三十年的努力一直未能识别出临床上可行的KRAS蛋白抑制剂，主要有两个原因：(1)KRAS以皮摩尔亲和力与GDP和GTP结合，严重阻碍了开发核苷酸竞争抑制剂的努力;(2)KRAS蛋白缺乏其它深表面疏水口袋，阻碍了寻找高亲和力变构抑制剂的努力[1][2][3]。

　　事情在2013年出现了重大突破，Shokat等[4]报告了一种旨在克服这些挑战的新策略，该策略使用共价抑制剂来靶向KRASG12C的活性半胱氨酸。野生KRAS与GDP结合的晶体结构图如下图3左图所示[5]。结晶学研究表明，在效应因子结合的Switch-II区域的下面形成了一个新的口袋，值得注意的是，突变体cys12位于与效应因子相互作用有关的核苷酸口袋和切换区附近(如下图1右图所示)，基于二硫化物的片段筛选法在GDP结合状态下利用完整蛋白质质谱法对有480个系链化合物的文库进行了筛选，得到了片段6H05和2E07，且两个片段化合物未检测到与含有3个天然半胱氨酸残基的野生型K-RAS的反应。

　　选取最优片段6H05进行构效关系研究，得到了最高活性化学物(6)，结合模式如右图所示(如下图2左所示)，化合物6不结合在核苷酸口袋中，而是从Cys12延伸到主要由Switch-II组成的相邻口袋中。这种完全形成的口袋在RAS的其他已发表的结构中并不明显，尽管在某些情况下可以看到凹槽，以前的研究表明这个区域存在变构位点。将复合结合区称为Switch-II口袋(S-IIP) [4]。

　　S-IIP位于RAS的中心β-折叠与α2-(Switch-II)和α3-螺旋之间，明确的电子密度显示了化合物6在S-IIP内部的位置，并证实了6与Cys12之间的二硫键(如下图3左所示)。6的疏水二氯苯基形成几个疏水接触。Glu99和Gly60形成直接氢键至6(如下图3右所示)。而Switch-II对形成S-IIP有明显的重排作用，Switch-I的构象没有从GDP结合状态改变[4]。

　　Shokat等没有继续使用基于二硫化物的化合物，而是转向了碳基亲电剂、丙烯酰胺和乙烯基磺酰胺，得到了高效的丙烯酰胺类化合物，其中化合物12活性很好，如下图6所示。同时又证明了化合物12不和野生型KRAS的半胱氨酸反应。覆盖多个共晶结构表明，化合物通过口袋遵循类似的轨迹，并将官能团投射到(o-)和(p-)子口袋中。尽管末端苯环上有相当大的差异，但这些化合物满足相似的疏水相互作用，支持S-IIP的这一区域的关键作用(如下图4所示) [4]。

　　EDTA对核苷酸交换的催化作用表明，虽然化合物可能会微妙地影响金属结合，导致核苷酸亲和力的变化，但即使在S-IIP被占据的情况下，Mg2+也不能被排除。结构分析还预测，交换因子SOS的功能可能会受到与S-IIP结合的影响。用化合物8或12阻断SOS催化的核苷酸交换处理K-RAS(G12C)，如上所述，这些化合物不会损害EDTA催化的GDP交换，具体结果如下图5所示[4]。

　　图5. SOS催化的全长K-RAS(G12C)的核苷酸交换单独(a)，或用8(b)或12(c)标记的KRASG12C;(a)a-c.e的图式表示;(e)a-c图的半衰期

　　接着用免疫共沉淀法发现了化合物12将破坏RAS的GTP状态的构象，并损害与效应因子(如Raf)的相互作用。在一小部分基因表型的肺癌细胞系中研究了化合物12的作用。如预期的那样，与没有G12C突变的组(H1437、H1299和A549)相比，含有G12C突变的细胞系(H1792、H358、H23和CALU-1)在处理后显示出存活率降低和凋亡增加，如下图6(左)图所示。高敏感的H1792细胞显示低水平的K-RASGTP，与抑制剂与K-RAS GDP的优先结合一致，如下图6(中)图所示。它们是高度依赖K-RAS的如下图6(右)图所示。值得注意的是，缺乏G12C的K-RAS依赖性(A549)和非依赖性(H1299)细胞株对化合物12不敏感。化合物12在H1792细胞中的半数有效浓度(EC50)为0.32±0.01 μM[4]。

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