循环肿瘤 DNA(ctDNA)检测在精准肿瘤学中的应用越来越多，可能会偶然发现次要来源的分子信息。这些发现被识别并适当地用于诊断和治疗反应监测很重要。本文报道了一例患者，对已知前列腺腺癌进行连续游离 DNA(cfDNA)监测，意外发现 FGFR3-TACC3 基因融合、BRCA1 移码突变和其他分子异常。鉴于 FGFR3 融合在前列腺癌中的罕见性，检查是否存在第二原发癌症，导致无症状尿路上皮癌(UC)的诊断。开始针对UC的治疗后，cfDNA中这些分子变异的存在能够用于疾病监测和早期识别耐药，先于影像学进展。这些发现还揭示了针对FGFR和BRCA1的靶向治疗机会。

                                                                                                                          图片来源于网络，侵删

　　总体而言，本病例报道强调了纵向ctDNA监测用于早期癌症诊断、疾病预后、治疗靶点识别、治疗反应监测和早期耐药性发现的多方面效用。

　　研究背景

　　研究表明，循环肿瘤 DNA(ctDNA)分析能够揭示实体瘤可操作驱动突变，未来在癌症诊断和监测方面也具有潜在用途。“分子缓解”的概念，定义为治疗后ctDNA减少，与传统的评估(如影像学缓解和生存期)相关，但尚未在实体瘤中得到充分验证。最近，在接受手术切除的 2 期结直肠癌中，基于 ctDNA 指导辅助化疗降级，导致化疗使用减少，而无复发生存期未缩短。ctDNA用于早期癌症检测也在评估中。随着ctDNA检测在临床实践中的应用越来越多，临床医生将不可避免地遇到潜能未定的克隆性造血(CHIP)或先前未诊断的恶性肿瘤来源的分子发现。本文报道了一例已知患有前列腺腺癌的患者，进行ctDNA监测，导致无症状尿路上皮癌(UC)的快速诊断，并被纳入对治疗反应的纵向评估中。

　　病 例

　　临床病史

　　一名 73 岁的西班牙裔男性吸烟者患有生化复发性非转移性去势敏感性前列腺癌(PC)，雄激素剥夺疗法(ADT)下控制良好，在纵向 ctDNA 监测中发现其 PC 组织检测未报告的体细胞 DNA 变异，包括 FGFR3-TACC3 基因融合，引起对第二种恶性肿瘤的怀疑。

　　9年前，患者被诊断为前列腺腺癌，Gleason 4 + 3，血清前列腺特异性抗原(PSA)为 15.4 ng/mL。接受了调强放疗和 16 个月的 ADT，PSA 低点为 0.08 ng/mL。4年后，PSA 上升到 6.36 ng/mL，拒绝挽救性前列腺切除术，重新开始接受 ADT。从那时起，血清 PSA 一直稳定在<0.1 ng/mL的低水平。

　　初诊约 8 年后，接受了初始 PC 活检组织样本二代测序(NGS)，并开始纵向游离DNA(cfDNA)监测。每次随访时进行ctDNA液体活检，平均间隔三个月。最初，未报告异常，而在 PC 初诊约9年后，液体活检开始显示多个分子变异丰度(VAF)上升，包括 TP53 p.G245D、BRCA1 p.N1521fs、MYC 扩增和 FGFR3ex18-TACC3ex12。由于患者的初始PC组织不存在这些变异，并且FGFR3-TACC3融合在PC中非常罕见，我们进行了检查看是否存在第二种恶性肿瘤。影像学检查显示左侧输尿管肿块(活检显示高级别UC，GATA-3、P63、CK7 和 CK20 阳性)，病理性主动脉旁淋巴结，以及肝脏第 2 和第 6 分段病变肝活检显示转移性UC(mUC。肝活检样本 NGS 显示 FGFR3ex18-TACC3ex12 融合，有趣的是，该融合在原发性 UC 活检样本中未检测到。

　　开始顺铂和吉西他滨全身治疗。1个周期后，液体活检显示所有分子变异均消失。3个周期的化疗(计划共6个周期)后，担心顺铂肾毒性。重复成像显示所有部位疾病均获得缓解。鉴于影像学缓解和分子缓解(ctDNA消失)，决定降级治疗，改用帕博利珠单抗。6个月后，cfDNA NGS再次开始显示先前UC检出的异常，包括TP53 p.G245D，以及最终，BRCA1 p.N1521fs和FGFR3ex18-TACC3ex12融合。当时的再分期扫描未显示疾病的影像学进展。

　　再次出现UC相关ctDNA变异约4个月后，再分期成像显示T9椎体内可疑新硬化病变。所有既往病变，包括UC原发灶和肝转移灶，大小稳定。在与影像科讨论后，决定进行骨扫描，一个月后进行骨扫描，符合新的骨转移性疾病，硬化病变显示 T7-T10、T3、胸骨、右侧第二肋骨和左侧第九肋骨放射性示踪剂摄取。重复成像显示UC原发灶略微增大，已知肝转移保持稳定。在此期间，cfDNA中UC相关分子异常的VAF持续上升，且首次报告了额外的功能获得性(GOF)变异FGFR2 p.F276C和NRAS p.Q61L。同时，PSA维持在<0.1 ng/mL的低水平，cfDNA中未发现PC相关突变。因此，UC进展的可能性远高于PC复发。此时，提出进行UC进展治疗，但最终决定先对 T9 骨病变进行确认性活检，结果显示转移性 UC。不幸的是，组织不足以进行NGS检测。对 T9 骨病变进行放疗，ctDNA UC相关突变 VAF 迅速降低。然后开始FGFR抑制剂厄达替尼全身治疗，最初，ctDNA UC相关突变 VAF 进一步改善。但很快，TP53 p.G245D 和 BRCA1 p.N1521fs VAF 又开始上升，而FGFR3ex18-TACC3ex12和FGFR2 p.F276C VAF下降。同时，NRAS p.Q61L VAF迅速上升。综合这些结果，FGFR3ex18-TACC3ex12 和 FGFR2 p.F276C 对厄达替尼敏感，而 NRAS p.Q61L 可能为其耐药机制。

　　cfDNA测序数据的回顾性再分析

　　在上述患者病程中，实验室将NGS结果实时提供给医生。虽然 cfDNA NGS 的测序深度为 5000x，但报告的阈值是预先设定的，包括错义变异的 VAF 为 0.1%，插入/缺失为 0.5%，融合不清楚。因此，我们回顾性地试图通过重新比对原始测序数据来更好地了解患者的病程，看是否存在阈值以下的 UC 来源变异。

　　在 mUC 诊断前的一段时间的 cfDNA 样本中，我们自己的肿瘤知情重新比对和重新分析发现 TP53 G245D 和 BRCA1 N1521fs 突变分别在首次报告其存在的 12 个月(至少)和 8 个月前存在，VAF 分别为 0.24% 和 0.04%。FGFR3ec18-TACC3ex12 未在首次报告其存在之前存在。

　　在开始对 mUC 进行细胞毒性化疗后，临床 NGS 报告显示 UC 相关 cfDNA 呈阴性，持续约 6 个月。而肿瘤知情重新比对和重新分析发现，在这整个期间，TP53 G245D 在 cfDNA 中可检测到，而 BRCA1 N1521fs 在报告其再次出现的 2 个月前的 cfDNA 样本中存在。

　　总的来说，肿瘤知情重新比对和重新分析表明，UC相关体细胞突变可以在cfDNA中检测到，尽管VAF较低，但其存在先于首次出现在报告中至少12个月，先于临床 UC 诊断至少 18 个月，先于一线治疗后影像学证实进展至少 12 个月。

　　补充组织基因检测

　　实验室提供同源重组缺陷(HRD)检测，使用福尔马林固定组织样本，基于专有算法计算分数，预测肿瘤基因表达谱与 HRD 表型基准相关的概率，如在 BRCA 双等位基因缺失的肿瘤中所见。结果显示，UC 原发灶和肝转移分别为 88/100 和 96/100 的高阳性评分(阈值：>50/100 为 HRD+)。

　　讨 论

　　本病例中，mUC 在无症状的情况下，通过 cfDNA NGS 检测到先前在 PC 中未观察到的分子变异而发现。虽然其中一些新检测到的突变(如 TP53 和 BRCA1)相对非组织特异性，可能在 PC 克隆进化过程中获得，但 FGFR3-TACC3 融合在 PC 中极为罕见，高度提示新的 UC 原发灶。

　　成纤维细胞生长因子受体(FGFR)在细胞生长、分化和存活中起重要作用。FGFR 变异包括基因扩增、GOF 点突变和融合，导致下游信号通路组成型激活，促进癌变。FGFR融合常涉及FGFR2/3，可产生具有组成型活性酪氨酸激酶结构域的功能性融合蛋白。已经描述了许多 FGFR2/3 的融合伴侣，其中，FGFR3 常见的融合伴侣之一是转化酸性卷曲螺旋蛋白 3(TACC3)，见于多种肿瘤类型。该融合可能是4号染色体上的串联重复事件导致的。除了改变 FGFR3 激酶信号传导外，这些融合可能通过有丝分裂缺陷促进癌变。虽然几乎所有类型的实体瘤都记录了 FGFR 变异，但 FGFR3-TACC3 融合在 PC 中极为罕见，这引起了我们对第二原发恶性肿瘤的怀疑。

　　FGFR3 融合见于约 5% 的 UC。FGFR3ex18-TACC3ex12 融合存在于我们患者的 cfDNA 和肝转移灶，但不存在于原发性 UC。此外，诊断时肝转移灶中FGFR3ex18-TACC3ex12融合的丰度符合其仅为亚克隆事件，FGFR3ex18 65融合reads/1540 总reads，丰度为4.2%，而TP53 p.G245D VAF为74.2%，BRCA1 N1521fs VAF为68.6%。尽管研究显示，FGFR3 点突变是 UC 发生中的早期事件，且在非肌层浸润性 UC 中更常见，但 FGFR3 融合并不一定如此。随后ctDNA FGFR3ex18-TACC3ex12融合reads，归一化为总FGFR3ex18 reads和TP53突变VAF，在临床进展时相比初始肝转移灶和治疗前cfDNA，符合携带融合的克隆扩大。BRCA1 和 TP53 功能缺失(LOF)突变的共存，包括在原发性 UC 肿瘤中，也提示我们患者的肿瘤可能具有串联重复表型，可能在亚克隆群中产生了 FGFR3ex18-TACC3ex12 融合。该表型在乳腺癌和卵巢癌中得到了较多描述，同时存在 BRCA1 和 TP53 LOF突变导致全基因组不稳定性，表现为串联重复增加。

　　厄达替尼是一种FGFR1-4抑制剂，已获得FDA加速批准，用于携带具有易感FGFR改变的mUC。该批准基于一项 2 期单臂研究，该研究招募了具有 FGFR3 突变或 FGFR2/3 融合的 UC 患者。FGFR突变患者(49%)厄达替尼治疗的缓解率高于FGFR2/3融合患者(16%)。常见的融合是FGFR3:TACC3v1，4/11例(36%)携带该融合的患者获得客观缓解。一项验证性 3 期研究(THOR)比较了厄达替尼与化疗(研究者选择的治疗)用于 FGFR2/3 改变患者，发布了摘要，结果显示厄达替尼带来总生存期获益。在我们的患者中，厄达替尼最初对 TP53 p.G245D 和 BRCA1 p.N1521fs VAF 具有抑制作用，但很快又开始上升，而FGFR3ex18-TACC3ex12和FGFR2 p.F276C cfDNA下降。我们的纵向 cfDNA 监测提示，FGFR3ex18-TACC3ex12 和 FGFR2 p.F276C 激酶对厄达替尼敏感，而 NRAS p.Q61L 可能为其耐药机制。

　　在 mUC 中，铂类化疗的周期数尚不清楚。虽然 6 个周期是传统目标，但 3-5 个周期可能不劣于 6 个周期。目前尚无基于临床因素的治疗降级指南，尽管在实践中，毒性通常是剂量限制性的，对疗效的影响未知。在早期实体瘤中，治疗后的ctDNA水平与微小残留病灶相关，并预测复发。通过 cfDNA 监测指导化疗降级是多种癌症类型中正在研究的策略。在新辅助治疗中，新辅助治疗后ctDNA的清除率与病理完全缓解相关。我们的患者最初肿瘤相关变异快速降低提示对化疗的临床反应良好，促使改为维持免疫治疗的决策。尽管我们的患者最终出现分子复发，随后临床复发，但临床无进展间隔超过了 mUC 维持免疫治疗试验中报告的中位数。

　　我们患者的 UC 携带几个分子变异，可以通过 ctDNA 分析进行纵向跟踪，作为传统影像学的补充。一个周期的化疗后，这些分子变异降至临床报告阈值以下。已知肿瘤相关变异的再次出现，如本病例情况，可以作为早期预警信号，可能先于即将发生的临床复发。此外，新变异的出现可能提示克隆进化和耐药机制的出现，例如，本病例中的NRAS p.Q61L。治疗期间纵向 cfDNA 监测与治疗失败和疾病进展时间密切相关，可提示密切疾病监测。越来越多的证据表明，仅基于 ctDNA 动态进行早期干预可以延迟雌激素受体阳性乳腺癌明显临床进展的时间。然而，在任何肿瘤类型中，仅基于ctDNA制定治疗决策能否成为标准方案，还需要更多的验证。

　　关于我们患者的 UC，血液和组织还检测到 BRCA1 LOF 突变(组织中的 VAF 为 88.3%，提示双等位基因缺失)。与此一致，HRD-RNA 评分(经验证可检测 HRD 转录特征)显示 UC 原发灶和肝转移灶均 HRD 评分高。BRCA1/2 LOF 突变存在于 5-10% 的 UC 患者，尽管预计其中只有少数患者具有 HRD 表型，这可能是因为其余患者缺乏位点特异性杂合性缺失。基于 RNA 的 HRD 检测显示，3.4% 的膀胱癌具有同源重组缺陷。同源重组缺陷可以预测尿路上皮癌对铂类化疗的敏感性。铂类化疗后，聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂卢卡帕利可延长具有 HRD 或 HRD 相关突变的 mUC 患者的 PFS。在BRCA1 LOF突变的患者中也报告了对奥拉帕利的反应。携带同源重组修复基因突变(包括 BRCA1/2)的未经治疗、不适合铂类化疗的 UC 患者也可能获益于 PARP 抑制剂奥拉帕利联合 PD-L1 抑制剂度伐利尤单抗。我们患者的 BRCA1 突变 VAF 提示，该分子事件是在该肿瘤进化的相对较早获得的，原发灶和转移灶的高 HRD 评分也支持这一点。因此，尽管目前 FDA 尚未批准 PARP 抑制剂用于 UC 任何阶段的治疗，但如果标准治疗方案已用尽，并且当时的基因检测继续显示主导的 BRCA1 突变/HRD+ 克隆，仍可考虑 PARP 抑制剂作为后线治疗。

　　我们患者的 UC 原发灶携带亚克隆 BRAF p.G469A 突变，该突变在肝转移灶中未检测到。该突变在ctDNA临床报告中未报道过。然而，我们自己对原始测序文件的重新比对发现了一个阳性样本，是在初诊时间附近(即在疾病负荷高峰)收集的，VAF为0.04%，并且在临床进展(再次，高肿瘤负荷时间点)时收集的样本中，该突变再次检测到，VAF为0.02-0.03%。有研究将致癌性 BRAF 突变根据其作用机制进行分类。I 类 BRAF 突变包括经典 BRAF p.V600E 突变，为非RAS依赖型单体。基于两项篮子试验，FDA 批准了 BRAF 抑制剂达拉非尼联合 MEK 抑制剂曲美替尼用于携带 BRAF V600E 突变的泛癌种患者。II 类 BRAF 突变，包括在我们的患者中发现的 p.G469A，为非RAS依赖型二聚体，对现有的 BRAF 抑制剂(如达拉非尼)具有耐药性，但有少数病例报告，其对跨适应症 MEK 抑制剂具有一定的临床敏感性。在我们的患者中，BRAF 突变的亚克隆性质、完全不存在于转移灶，以及缺乏 BRAF 或 MEK 抑制剂对非 V600 BRAF 突变有活性的有力证据，使得 BRAF 靶向治疗的吸引力较低。

　　虽然我们患者的 UC 是在对其已知 PC 的 cfDNA 监测中偶然发现的，但该病例也说明了 cfDNA 在早期发现癌症方面的潜力，尤其是对于没有筛查指南的组织学(例如 UC)。PATHFINDER 研究评估了在没有已知癌症诊断的受试者中进行的多癌种早期检测(MCED)甲基化筛查，在 1.4% 的患者发现癌症信号，其中 38% 的患者最终被诊断为癌症。平行 SYMPLIFY 研究纳入了出现可能与癌症相关的非特异性症状的受试者，MCED 检测的阳性预测值为 75.5% ，尽管检测癌症的敏感性在 I 期患者中低于 IV 期患者(24.2% vs 95.3%)。CancerSEEK检测是覆盖16个癌症相关基因的基于PCR的检测，在PET成像的支持下，灵敏度为15.6%。使用cfDNA进行多种癌症筛查仍然是一个积极研究的领域。

　　总之，本病例报道强调了纵向cfDNA监测能够用于早期癌症检测、识别个体化治疗靶点、监测治疗反应、预测临床复发/进展和分析耐药机制，改变临床肿瘤学实践。

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