癌症研究过程中一个主要的挑战是为新疗法开发强大的临床前药效评价模型，这些模型将准确反映人类对新药的反应。通常，在细胞或动物模型中最初看起来很有希望的潜在治疗，往往应用到癌症患者身上时反而效果不佳。

　　鉴于临床试验的巨大成本，研究人员迫切需要一种能够准确反映人类疾病遗传信息的临床前研究模型，这些模型可靠地预测哪些药物最有可能让患者受益。

　　本周在Cell Stem Cell上发表了一项关于潜在临床前评价新模型的研究。该研究由Zuzana Tothova博士领导的团队完成，他是麻省理工学院和哈佛大学的博士后，研究员，Dana-Farber癌症研究所（DFCI）的医学教授，另外的成员还有Broad研究所的Ben Ebert教授，他是哈佛医学院的教授、DFCI医学肿瘤学主席。

　　Zuzana Tothova博士说：“使用多重CRISPR技术了对人造血干细胞进行基因编辑，随后移植进入小鼠中，定制生成的这种小鼠模型可用于白血病的研究。在许多不同的实验中，动物模型可以成功的反映用于治疗血液肿瘤制剂的反应。 而通过我们的模型，可以在正确的环境中以非常受控的方式进行测试，并使用正确的细胞，这些细胞包含了对特定药物反应的遗传预测基因。”

　　1、从疾病的遗传信息中找到癌症驱动基因

　　研究小组开始研究Ben Ebert实验室和“癌症基因组图谱”中的大规模测序数据，以确定哪些组合突变最常见于骨髓增生异常综合征（MDS）、急性骨髓性白血病（AML）以及骨髓衰竭的血液癌症。通过数据分析，研究人员最后将目标放在MDS和AML两中疾病中经常突变的9个基因。

　　Ben Ebert解释说：“通过类遗传学的研究，我们知晓了哪些突变组合会导致癌症。 如果我们有足够的肿瘤测序数据，就可以确定突变基因以及那些突然发生的偶然突变组合。

　　目前，许多癌症模型（如细胞系）不反映特定研究者想要研究的癌症遗传学背景，这往往使研究人员和患者均处于不利地位。一种策略是将实际的人类癌症组织移植到小鼠中（PDX模型），但是癌组织通常不能很好地植入，研究人员只能够针对特定癌症样本中累积的突变的特异性组合进行测试。

　　为了综合研究这些特定的驱动MDS发生的突变基因，该团队开发出一种新方法将其插入到新的实验室模型中。

　　Tothova说：“通过对癌症测序工作的深度分析，我们正在尝试开发一种针对特定突变组合的新药评价方法。 您可能没有任何样品可用于特定突变组合的研究，我们希望能够设计人体细胞中的正确病变，让其在小鼠中扩增，并产生准确的疾病遗传模型以测试对新药的反应。这是癌症研究人员和制药行业一直以来都期望达到的目标。”

　　2、多重CRISPR基因编辑技术定制癌症突变

　　为了创建具有正确突变的模型，Tothova和她的团队建立了一个可定制的系统，将癌症的驱动突变引入MDS和AML起源的人类造血干细胞中。这些研究人员已经在造血干细胞和祖细胞方面有广泛的经验，细胞主要来自脐带血或成人骨髓。并且在2014年，他们在Nature Biotechnology（自然生物技术）上发表了一篇论文，用CRISPR-Cas9的编辑方法创建相似的小鼠癌症模型。这一次，该团队的目标是在人体细胞中建立MDS，这是一个更具挑战性的目标。

　　研究人员从健康供体中采集原代细胞，并使用多重CRISPR技术对其进行多个不同突变组合的编辑，而不是单一基因的改变，以反映患者肿瘤突变的复杂性。这些突变的组合要是细胞可耐受的，也就是说是一种成功地改变基因而不杀死细胞的突变组合，并且随着时间的推移，细胞扩增后还能观察到这些突变。

　　到目前为止，还没有人用多重CRISPR技术对人造血干细胞进行编辑，添加特异性突变以产生疾病模型。之后，研究人员将编辑过的干细胞注入小鼠的血液循环系统，其中一部分进入骨髓。该小组在五个月后监测其进展情况，然后提取细胞进行测序，以确定这些编辑后的细胞已经成功繁殖。

　　3、药物测试新模型

　　MDS患者的主要治疗方法是使用azacitidine和地西他滨的低甲基化剂。基于以前的研究，该团队确定了可用于预测癌细胞对这些化合物反应的特定遗传突变。（例如，称为TET2的基因中的突变可预测MDS患者是否治疗成功，而ASXL1基因突变则预测肿瘤是否发生耐药）。

　　研究人员用azacitidine处理小鼠时，发现这些基因工程编辑细胞的反应与人类的数据预期相符：TET2突变细胞对药物有反应，而ASXL1突变的细胞对治疗有耐药性。该团队还发现，凝血酶基因SMC3中的突变增加了对药物的敏感性。

　　Tothova说：“我们能够概括出人类临床试验中以前的发现，这使我们对这些模型的价值更有信心。 来自患者的测试数据反映了我们试图理解的最重要的实验。”目前她正在与DFCI的临床研究者合作，计划将其中一些发现应用到临床试验中。

　　该团队认为，只要可以选择适当的突变的测序数据，同时可以从期望的组织中获取祖细胞，就可以将血液肿瘤中的测试方法应用到其他类型的癌症。Zuzana Tothova博士说：“现场的人们对这些模型很渴望，我们正在分析正确的细胞背景，然后对疾病进行建模，我们期望其带有的遗传复杂性能够直接反映我们在患者中看到的一样，这在以前没有人可以完成，我们深信可能成为一个非常有益的工具。”

　　4、多重CRISPR基因编辑技术

　　CRISPR是规律成簇的间隔短回文重复（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）的缩写。CRISPR与内切酶Cas9组成的防御系统让细菌对抗外来侵略者。CRISPR-Cas9能够在引导RNA的指引下，靶标并切割入侵者的遗传物质。此后研究者们利用这一特点，将CRISPR系统发展成了强大的基因组编辑工具。

　　CRISPR/Cas9是继ZFN、TALEN之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”，这几年成为生物技术领域的热点。在科研领域，它已展现了巨大的潜力，并帮助科学家们建立了一个个不同的疾病模型，让我们了解特定基因的重要性。而多重CRISPR技术也是去年红极一时的基因编辑新技术。

　　2015年9月

　　以张锋教授研究团队为主的科学人员报告了一种新的CRISPR效应分子Cpf1，该研究以“Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System”为题发表在2015年九月的cell杂志上。他们证明Cpf1具备介导强大的DNA干扰并且不同于Cas9的功能。

　　2016年4月

　　来自哈尔滨工业大学生命学院的中国科学家黄志伟教授团队在Nature在线发表了题目为“The crystal structure of Cpf1 incomplex with CRISPR RNA”的研究论文。该项研究通过结构生物学和生化研究手段揭示了CRISPR-Cpf1识别CRISPR RNA （crRNA）以及Cpf1剪切pre-crRNA成熟的分子机制。

　　2016年4月

　　来自德国马克斯普朗克感染生物学研究所的Emmanuelle Charpentier博士也在Nature上在线发表了题为“The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA”的研究论文。

　　该项研究描述了Cas9的一种潜在替代者，来自土拉热弗朗西丝菌（Francisella novicida）的CRISPR结合蛋白Cpf1的特征：Cpf1具有双重切割活性，不仅切割DNA，而且也切割RNA。与CRISPR-Cas9不同的是，Cpf1能够独自地对pre-crRNA进行加工，然后利用加工后产生的crRNA特异性地靶向和切割DNA，因而也就不需要来自宿主细胞的核糖核酸酶（RNase）和tracrRNA，这是人们迄今为止发现的一种最简单的CRISPR免疫系统。这一发现可能给科学家们提供一种新的序列特异性基因组编辑方法，更为重要的是，还可能便于一次对多种靶位点进行编辑，即所谓的多重编辑。

　　2016年12月

　　张锋所在的Broad研究所和Wageningen大学的John van der Oost教授在Nature Biotechnology上发表题为“Multiplex gene editing by CRISPR–Cpf1 using a single crRNA array”的研究，实现了CRISPR的一项新突破，即利用CRISPR–Cpf1打造了一个多重化基因编辑系统。