因科学家们在免疫检查点抑制剂疗法和CAT-T细胞免疫疗法取得的重大进展，癌症免疫疗法被《Science》期刊评为2013年年度十大科学突破之首。

　　PD-1阻断+CAR-T联用

　　文/towersimper

　　鉴于CAR-T细胞免疫疗法和PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂都存在各自的缺陷：

　　CAR-T细胞需要PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂在肿瘤微环境中抵抗免疫抑制。

　　而PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂需要在肿瘤微环境中有足够的肿瘤特异性T细胞。

　　一种有前景的方法就是将这两类免疫疗法结合起来，发挥1+1≥2的效果，极大地提高治疗人类肿瘤的疗效。

　　同时降低药物的毒副作用，从而让患者从中受益。

　　CAR-T疗法的优点和缺陷

　　CAR-T(ChimericAntigenReceptorT-CellImmunotherapy)，即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。

　　该疗法是一种出现了很多年，但近几年才被改良使用到临床中的新型细胞疗法。

　　在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。

　　近年来，CAR-T免疫疗法除了被用来治疗急性白血病和非霍奇金淋巴瘤之外。

　　经改进后，也有望用来治疗实体瘤、自身免疫疾病、HIV感染和移植排斥等疾病，具有更广阔的应用空间。

　　正如所有的技术一样，CAR-T技术也经历一个漫长的演化过程，正是在这一系列的演化过程中，CAR-T技术逐渐走向成熟。

　　图1.CAR-T细胞免疫疗法示意图，图片来自FrontiersinImmunology,doi:10.3389/fimmu.2016.00353.

　　这种新的治疗策略的关键之处在于构建一种被称作嵌合抗原受体（chimericantigenreceptor,CAR）的人工受体来特异性地识别在癌细胞表面上表达的抗原。

　　如B细胞恶性肿瘤的CD19、CD20和CD22，胶质母细胞瘤的EGFRRVIII。

　　CAR由一段胞外单链抗原可变区片段（scFV）、跨膜区和胞内信号区3个部分组成。

　　第一代CAR将scFV区与激活抗原特异性T细胞的CD3ζ胞内信号区连接。

　　之后，开发的CAR包含了额外的共刺激信号（CD28、4-1BB和OX40，第二代CAR包含其中的一个，第三代CAR包含其中的两个）来增强和维持T细胞功效。

　　然而，患者的T细胞本身并不表达这种CAR，毕竟它是一种人工受体，是特异性地针对癌细胞表面上存在的抗原人工设计出来的。

　　在人体临床试验中，科学家们通过一种类似透析的过程提取出病人体内的一些T细胞。

　　在实验室对它们进行基因修饰，将编码这种CAR的基因导入，这样这些T细胞就能够表达这种新的受体，如图1所示。

　　这些经过基因修饰的T细胞在实验室进行增殖，随后将它们灌注回病人体内。

　　这些T细胞利用它们表达的CAR受体特异性地结合癌细胞表面上的抗原上，从而触发一系列信号转导事件。

　　最终强效地摧毁体内的癌细胞。

　　CAR-T细胞免疫疗法尽管在治疗血液肿瘤中有巨大的希望，但是同时也存在较大的副作用。

　　CAR-T细胞免疫疗法带来一个巨大的临床风险就是细胞因子风暴。

　　当CAR-T细胞快速杀死癌细胞时，产生的大量细胞因子会对宿主其他组织器官发起惊人的攻击，导致高烧、低压、休克甚至死亡。

　　此外，血液肿瘤仅是癌症中的一小部分。

　　作为癌症中的大头，实体瘤远比血液肿瘤复杂得多。

　　尽管初步研究已表明CAR-T细胞免疫疗法在实体瘤方面具有不错的安全性和有效性。

　　但是接受治疗的患者也会出现败血症、气短和白细胞水平升高等副作用。

　　对实体瘤的治疗似乎并没有想象中的那么乐观。

　　免疫检查点抑制剂疗法的优点和缺陷

　　在正常情况下，为了阻止活化的T细胞破坏正常的人体细胞，免疫系统能够通过激活PD-1/PD-L1等免疫检查点来控制T细胞的活化进程。

　　防止出现T细胞错误地攻击正常的细胞。

　　然而，癌细胞通过表达表面蛋白PD-L1特异性地识别T细胞表面上的PD-1，窃取这种控制机制。

　　从而激活免疫检查点来抑制T细胞的免疫活性，这就会导致癌细胞逃避免疫识别和茁壮生长，如图2所示。

　　这就为癌症治疗开创了全新的免疫治疗思路——通过免疫检查点抑制剂阻断CTLA-4或PD-1等免疫检查点。

　　阻止癌细胞窃取这种控制机制，从而释放免疫系统自身的能力来攻击癌症。

　　图2.肿瘤细胞逃避T细胞免疫识别机制，图片来自NatureReviewsCancer,doi:10.1038/nrc3239.

　　免疫检查点抑制剂治疗通过抑制免疫检查点活性，释放肿瘤微环境中的免疫刹车，重新激活T细胞对肿瘤的免疫应答效应。

　　从而达到抗肿瘤的作用。PD-1的天然配体有两个，分别为PD-L1和PD-L2。

　　目前研究和应用最广泛的免疫检查点抑制剂之一就是PD-1/PD-L1的抑制剂，如图3所示。

　　图3.PD-1/PD-L1抑制剂作用机制，图片来自TrendsinMolecularMedicine,doi:10.1016/j.molmed.2014.10.009.

　　目前，实际上只有约20%～40%的患者能够从PD-1/PD-L1抑制剂治疗中获益。

　　两个重要因素是免疫抑制性的肿瘤微环境中缺乏肿瘤特异性T细胞和T细胞经历功能性耗竭。

　　两类免疫疗法联用的进展和前景

　　近年来，科学家们在CAR-T细胞免疫疗法和PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂联用方面不断取得进展。

　　让我们一起看看这个领域取得的最新进展。

　　图4.表达抗PD-1抗体的CAR-T细胞免疫疗法作用机制，图片来自NatureBiotechnology,doi:10.1038/nbt.4195.

　　2018年8月，SarwishRafiq等人构建出两类新型CAR-T细胞：一类靶向在某些血癌细胞中表达的CD19抗原。

　　另一类靶向在某些卵巢癌和胰腺癌等实体瘤中表达的MUC16抗原。

　　接着，通过基因改造，将一种抗PD-1抗体的简化版本---单链抗体可变区片段（scFv）---的编码基因导入到已经构建好的CAR-T细胞中。

　　这样经过基因改造后的CAR-T细胞就能够分泌scFv[1]，如图4所示。

　　他们发现在实体瘤和血癌的多种小鼠模型中，这两类新型CAR-T细胞在体内存留时间更长，疗效更好。

　　更重要的是，由于免疫检查点抑制剂scFv在癌症附近释放，它们能够激活癌症附近的T细胞。

　　从而招募患者自身的T细胞一起来杀伤癌症。

　　再者，血液中具有很低的scFv水平，这表明这种免疫检查点抑制剂没有扩散到离癌症很远的地方。

　　这样就能够降低全身性的副作用。

　　2017年2月，NanChen等人通过基因工程技术构建了CAR-T细胞过表达PD-1显性阴性受体（DNR,缺乏PD-1跨膜区和胞内信号区的PD-1受体）。

　　实验结果确实表明：

　　与单纯的M28zCAR-T细胞相比，表达PD-1DNR的M28zCAR-T细胞（第二代CAR-T细胞中的一种）在遭受重复抗原刺激下，具有改善的增值能力、细胞毒性和细胞因子分泌[2]。

　　实体瘤小鼠模型实验也表明：

　　表达PD-1DNR的M28zCAR-T细胞能更好控制肿瘤负荷和延长中位生存期。

　　不过，一些小鼠在使用单剂量的表达PD-1DNR的M28zCAR-T细胞后出现了肿瘤复发。

　　2017年，胥阶英构建出靶向EGFR家族成员并且高水平稳定表达抗PD-1抗体的HerinCAR-T细胞。

　　实验结果表明当进行共培养时，表达表达抗PD-1抗体的HerinCAR-T细胞能够更有效地杀伤肺癌细胞株NCI-H1299、NCI-H460、NCI-H23和H446。

　　在NCI-H460小鼠移植瘤模型中，分泌PD-1抗体的CAR-T细胞能够在小鼠体内更好地增殖和更有效地抑制肿瘤的生长[3]。

　　图5.利用CRISPR/Cas9构建缺乏PD-1的CAR-T细胞流程.

　　2017年4月，WendellLim及其团队以慢病毒为载体运送CRISPR/Cas9编码基因。

　　从而构建出缺乏PD-1的anti-CD19CAR-T细胞，如图5所示。

　　这种PD-1破坏增强了CAR-T细胞介导的体外肿瘤细胞杀伤并增强了清除体内PD-L1阳性肿瘤异种移植物的效果。

　　这就为利用精确基因组工程改进下一代细胞疗法铺平了道路[4]。

　　2016年7月，LeonidCherkassky等人利用胸膜间皮瘤的原位小鼠模型发现：

　　肿瘤微环境中的PD-1上调会抑制基于CD28和4-1BB共刺激的第二代CAR-T细胞的功能。

　　然而，通过抗PD-1抗体、细胞内源性PD-1shRNA阻断或PD-1显性负性受体（PD-1DNR）阻断干扰PD-1/PD-L1通路能够恢复CAR-T细胞的效应功能[5]。

　　这表明阻断PD-1/PD-L1可能是一种改善CAR-T细胞免疫疗法疗效的有效策略。

　　2018年1月，Kite制药公司（KitePharma）公布一项名为ZUMA-6的I/II期临床试验结果（NCT02926833）。

　　证明了它的anti-CD19CAR-T细胞产品Yescarta（axi-cel）联合罗氏的PD-L1抑制剂Tecentriq治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者安全有效[6]。

　　总体有效率（ORR）为89%（n=8/9），其中完全缓解率（CR）为56%（n=5/9）。

　　除了提起的Kite制药公司和罗氏之间共同开展的CAR-T与PD-L1联合用药的临床试验之外。

　　Juno治疗公司（JunoTherapeutics）也与阿斯利康达成了合作协议。

　　共同推进它的在研CAR-T细胞产品JCAR014联合后者的PD-L1抑制剂Durvalumab治疗非霍奇金淋巴瘤的临床试验（NCT02706405）。

　　当前，CAR-T细胞免疫治疗技术的一个不足之处在于灌注到患者体内后，T细胞倾向于变成“耗竭（exhausted）”状态。

　　相比于对抗疾病的功能性T细胞，耗竭T细胞的一个比较明显的区别是它们能够表达PD-1。

　　2016年12月，鉴于NicholasHaining及其团队发现在慢性病毒感染的小鼠中，不同于能够有效对抗感染或癌症的T细胞的是：

　　耗竭T细胞受一组不同的分子通路控制。

　　他们还发现借助于CRISPR/Cas9技术剔除一段促进PD-1产生的耗竭特异性增强子，会降低PD-1表达。

　　这就为改善CAR-T细胞免疫疗法提供了可能[7]。

　　与此同时，Haining团队在另一项研究中发现阻断PD-1使得耗竭T细胞短暂地获得了功能性T细胞的功能。

　　但是在表观遗传学方面很大程度上仍然是未改变了，这表明阻断PD-1带来的益处来自于耗竭T细胞的短暂活化。

　　而不是它们在耗竭状态上的永久性改变[8]。

　　2017年2月，EliseChong等人报道了一个病例：

　　一名患有难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）和进展性淋巴瘤的患者在接受靶向CD19的CAR-T细胞免疫疗法后接受抗PD-1抗体治疗。

　　结果这名患者具有临床显著的抗肿瘤反应。

　　CAR-T细胞发生增殖和降低这些T细胞中的PD-1和Eomes共表达[9]。

　　这个病例表明抗PD-1抗体可有效治疗对CAR-T细胞免疫疗法不作出反应的癌症。

　　2016年6月，TessaGargett等人构建出靶向GD2的第三代CAR-T细胞。

　　并发现体外培养时，在遭受重复抗原刺激下，CAR-T细胞发生显著的激活诱导细胞死亡（activation-inducedcelldeath,AICD）。

　　而PD-1阻断可增加CAR-T细胞存活，促进它们杀灭PD-L1阳性的黑色素瘤细胞系[10]。

　　他们在治疗转移性黑色素瘤时，评估了CAR-T细胞在参与I期临床试验CARPETS的患者中的持久性。

　　这些数据表明PD-1靶向组合治疗方法可能用于增强CAR-T细胞的疗效和在患者体内的持久性。

　　图6.PD-1阻断在体内增强CAR-T细胞免疫治疗效果，图片来自OncoImmunology,doi:10.4161/onci.26286.

　　2013年10月，LizaJohn等人构建出靶向Her-2的CAR-T细胞。

　　在Her-2转基因受者小鼠的过继转移研究中，在接受靶向Her-2的CAR-T细胞与抗PD-1抗体组合治疗后。

　　对两种不同Her-2阳性肿瘤的生长抑制得到显著改善。

　　这种改善与CAR-T细胞的功能增强（其特征就是更高的胞内IFNγ表达）存在关联[11][12]，如图6所示。

　　他们还在接受这种组合治疗的小鼠的肿瘤微环境中观察到：

　　Gr1+CD11b+髓源性抑制细胞（myeloid-derivedsuppressorcell）所占的比例显著下降。

　　这种组合疗法不会导致这些小鼠出现自身免疫反应。

　　2017年3月，InnaSerganova等人构建出靶向人前列腺特异性膜抗原（hPSMA）的人CAR-T细胞。

　　在Myc-CaP前列腺瘤小鼠模型中证实相比于单独使用过继性CAR-T细胞免疫疗法时，CAR-T细胞免疫疗法与抗PD-1单抗联用可增强CAR-T细胞的疗效。

　　不过，这种治疗反应持续时间相对较短，这提示着其他的免疫调节机制限制着CAR-T细胞在小鼠前列腺瘤中的功能和持久存在[13]。

　　迄今为止，科学家们利用CAR-T细胞免疫疗法和PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂开展组合治疗的研究并不多见。

　　以上列出的一些研究是其中的典型代表。

　　目前的这种组合治疗仅局限在细胞模型和动物模型上。

　　或者虽然已开展人体临床试验。仍然停留在I期期临床试验阶段。

　　参与临床试验的患者人数仍然偏少，仍需通过招募更多的患者人数来开展II期和III期临床试验。

　　最终，能否得到各国监管机构的批准，仍是未知数。

　　未来，随着科学家们不断取得新的突破，这种组合治疗有望为更多癌症患者带来福音。

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