在临床上，对肿瘤的分类是癌症诊断、判断预后以及治疗方案选择的重要依据。目前这种分类主要是依据肿瘤组织学特征以及少量Marker的表型进行的。近年来，随着单细胞分析技术的发展，肿瘤患者个体间以及个体内普遍存的异质性被不断被揭示出来，这些复杂的单细胞表型及空间信息并未反映在组织学分类中。

　　近日，来自苏黎世大学Bodenmiller教授所带领的研究团队在这个领域获得了突破。他们从大量包含空间信息的单细胞数据中，找到了与疾病预后相关的分类模式，可能为癌症患者的个体化诊断和治疗提供依据。

　　这是一项具有里程碑意义的回顾性临床研究。University Hospital Basel和 University Hospital Zurich两所医院为这项研究提供了总计353例乳腺癌病人的FFPE切片样本，同时提供的还有其中281例病人的长期生存数据，为后续的检测和分析打下坚实的基础。

　　Fig1. 研究人员通过Hyperion获得乳腺癌组织包含35个marker的表达数据的高维图像，

　　图中展示的是Hyperion的检测原理，研究所使用的Panel设计，以及部分伪彩组织图片;

　　利用Hyperion组织成像质谱流式系统(简称Hyperion)，研究人员检测了切片样本上35个marker的表达和定位，获得了720张高维肿瘤病理图像。这些图片中包含大量关于组织细胞的定位、表型的信息，如何将这些信息解析出来并与临床数据产生联系，成了下一步的关键。研究人员的分析思路很具有启发性，他们主要着眼于两个方面：肿瘤组织细胞的表型，以及它们位置关系。

　　依照单细胞表型对组织细胞进行分类

　　细胞表型方面的分析相对简单，研究人员首先利用Cellprofiller等单细胞化工具识别出组织图像中的每个细胞，由此可以得到单细胞水平的marker表达数据。随后采用一些成熟的聚类方法(例如：PhenoGraph、层次聚类)将组织细胞划分成了27个元群(metacluster*)。他们包含了6个免疫细胞元群，6个间质(Stromal)细胞元群以及13个上皮性质(Epithelial)的肿瘤细胞元群。

　　Fig2. 图像单细胞化后，根据单细胞表达数据聚成的27个元群(metacluster)

　　A. tsne 降维分析展示肿瘤组织的元群组成

　　B. 示例图片，展示不同元群细胞在组织中的位置

　　C. 示例图片，展示组织中肿瘤和间质细胞元群所在的区域Scale bar：100μm

　　组织中的细胞"群落"(community)

　　与细胞表型同样重要的，是它们的位置关系，因为组织细胞发挥功能往往不是各自独立的，而是相互协调、相互影响产生合力的过程。为了方便描述组织中这种复杂的多细胞相互作用模式，作者引入"群落"(Community*)的概念，一个"群落"中可以包含一个或多种不同种类的细胞相互作用。

　　组织中的"群落"的识别方法和目前流行的社交网络中"社区"(Social Community)识别非常类似，利用相同的算法，作者把肿瘤组织中的相互作用网络划分成了大小不一，组成不定的区块，这些区块就是一个个"群落"。依照运算时起始细胞种类的不同，作者对群落类型进行了进一步的定义。仅依照肿瘤细胞计算出的"群落"，本质上是一些大小不同的密集的上皮细胞斑块，它们被称为"肿瘤群落"(Tumour Community，TC)，而依照所有细胞计算出来的，则是包含肿瘤和基质细胞成分的 "微环境群落"(Microenvironment Community)。此外，根据他们的细胞组成，研究人员还对这些群落进行了进一步的分型。

　　Fig3. 组织细胞群落的识别和分型

　　A. 组织细胞群落的识别流程 B. 根据细胞组成对群落进行分型，上图：对肿瘤群落的tsne降维分析，一个点代表一个肿瘤群落，下图是对各分型肿瘤群落所包含的各元群细胞数的统计

　　单细胞病理学亚组，更精细的临床分类方法

　　接下来，作者深入研究了不同亚型的乳腺癌病例，在组织"群落"构成以及预后等方面的差异。大量数据表明，临床上的经典分类方法不能完全反映个体间及个体内存在的细胞异质性，而现在单细胞水平上的病理学分析可以提供比经典组织学更高分辨率的临床亚型分类方法。

　　研究人员计算了每个病例中各个元群细胞的比例，并据此进行聚类，将所有病例划分为18个SCP亚组(single cell pathology subgroup，即单细胞病理学亚组*)。相比经典的分类方法，这种分类更加精细：HRhi/+细胞富集的病例被分为6个不同的SCP 亚组(SCPs 1~5，12)而对于另一些仅具有少量的HRhi/+细胞的病例，目前他们在临床上并没有被很好的分类，在这里也被分成了6个不同的SCP亚组(SCPs 6~10，11)。

　　结合临床上收集的长期生存数据，研究人员发现很多SCP亚组表现出独特的临床预后特征。例如SCP 1主要由23号元群(表型为CK+ HRhi的肿瘤细胞)的细胞构成，这部分患者完全不屈服于疾病。与此相反，SCP3虽然包含相同的元群，但22和25两个元群的比例较高，结构上也由较小的肿瘤群落构成，则预后相对较差)(Fig4B)。

　　如果从肿瘤群落的构成的角度分析各个SCP的组织结构，可以明显看出一些规律。多数肿瘤构成上相对单一，主要由很少的几型肿瘤群落构成，而少数在群落构成上具有较高异质性的亚组，例如SCP8，则往往具有较差的预后。

　　Fig4. 单细胞病理学亚组表现出独特的临床预后特征

　　A. 经典临床分类下生存期曲线、B. 部分SCP亚组的生存期曲线

　　(注：黑色曲线为所有样本)

　　主持这项研究的是苏黎世大学定量生物医学系主任--Bernd Bodenmiller教授。他总结道，"单细胞分析表明，癌症患者个体间和个体内存在很大差异，但是目前基于组织病理学的癌症亚型鉴定方法并未考虑到这些分析得出的数据。我们的研究结果表明，与目前基于组织学的方法相比，组织成像质谱流式(IMC)提供了一种更高级的技术手段，可以识别与临床结果相关的单细胞特征。我们的发现揭示了多通道细胞空间信息的医学相关性，在未来，它将在推进精准医疗的发展过程中发挥潜力。"

　　这项研究的成功开展，得益于Fluidigm的Hyperion组织成像质谱流式系统的出色表现。与传统的免疫组化或者免疫荧光不同，Hyperion主要采用金属元素作为抗体的标签，利用质谱系统进行信号的检测。从原理上避免了荧光串色、组织背景等对于结果的影响，可在一次扫描中同时检测几十种蛋白质，是观察和研究健康和疾病组织的理想手段。

　　Fluidigm总裁兼CEO，Chris Linthwaite表示："单细胞空间图像和有关肿瘤微环境特征的数据为我们带来全新的思路，我们相信这项研究将进一步增加IMC技术在转化医学和临床研究中的应用，从而为将来癌症诊疗提供更好的预测方法以及个性化治疗方案。"

　　编者注：

　　?文中涉及大量关于细胞的分组以及样本的分组词汇，为了理解方便进行了灵活意译：

　　?Metacluster：本意是细胞的cluster再次聚类后产生的较大的cluster，这里将其称为"元群";

　　?Subgroup：是指对样本分组的细化，这里称为亚组，以便和前面细胞分群的概念相区别。

　　?Community：依照习惯，社交网络里的community称为"社区"，而为了理解方便，文献中提到的细胞组成的community被翻译为"群落";

　　参考文献：

　　1 Jackson， H.W.， Fischer， J.R.， Zanotelli， V.R. et al. "The single-cell pathology landscape of breast cancer." Nature. 20 January 2020， DOI： 10.1038/s41586-019-1876-x.

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