近年来，中国结直肠癌(colorectal cancer，CRC)的发病率和死亡率分列恶性肿瘤第二位和第四位，其发病率上升趋势明显，患病年龄趋于年轻化，已接近90年代的两倍。约80%的CRC患者首诊时已处于中晚期。根据最近发布的CRC 5年生存率数据，英国为54.3%(英国癌症研究/Cancer Research UK)，日本为65.8%(日本国立癌症中心发布)，美国已超过70%，中国为40.5%，而晚期患者仅为14%。

                                                                                                                                                图片来源于网络，侵删

      大量的研究资料和随访及监测的大数据证明，中国CRC发病率和死亡率高，五年生存率低的主要原因：①早期CRC患者仅占就诊比例的10%～20%;②在国家层面上CRC筛查与早诊早治起步较晚，且筛查与早诊早治质量参差不齐;③CRC治疗后复发率高，术后5年复发率I期约5%;II期约12%-15%;III期33%-35%，④尽管近年来CRC的治疗手段(包括靶向治疗、免疫治疗等)和治疗模式(包括新辅助治疗、全程新辅助治疗、转化治疗等)取得了较大进展，但治疗后随访和监测不规范，缺少预测术后复发或转移的有效手段，导致CRC患者治疗失败和死亡。

　　狭义的“肿瘤防治”是指科学预防肿瘤，早期筛查、早期发现肿瘤，早诊早治，降低肿瘤发病率和死亡率。广义的“肿瘤防治”，除了狭义的“肿瘤防治”内涵外，还包含肿瘤治愈性治疗后预防复发，实时监测评估预后，预测复发和转移，早期发现复发或转移，早期有效干预，安全有效地延长肿瘤患者的总生存期(overall survival OS)。

　　液体活检(Liquid biopsy，LBx)是广义的范畴，是指利用血液中的标志物来反映肿瘤的特定信息，主要是针对非固体生物样本(主要是血液)的采样和分析。LBx与组织活检(tissue/tumor biopsy，TBx)一样，主要用于癌症等疾病的诊断和监测，与组织活检相比具有无创、能动态监测等优点，能获得与组织活检相同的信息，满足对患者高频监测的需求。通过检测脱落到体液(血液、唾液、尿液等)中的循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA，ctDNA)等成分，分析ctDNA特征(点突变、片段化、拷贝数变异、甲基化等)，其技术涉及基因组、表观遗传学、微生物组、蛋白组、脂代谢等层面。

　　下一代测序(Next Generation Sequencing，NGS)技术已应用于ctDNA的测序。由于ctDNA是游离在血液中的携带突变的肿瘤DNA片段，几乎在所有实体瘤患者体液样本的无细胞成分中都可检测到ctDNA。因此，采用NGS分析ctDNA相对于正常基因组的位点突变信息可提供肿瘤诊断、疗效评价和监测实体瘤术后微小残留病灶(Minimal Residual Disease，MRD)，预测复发及提供评估预后的信息。近年来，基于NGS技术的循环肿瘤DNA可测残留病灶(Circulating tumor DNA-Measurable Residual Disease，ctDNA-MRD)检测成为学术界和临床研究的热点，来自临床研究的数据也越来越多。那么，ctDNA-MRD在预测CRC复发转移中的作用如何?面临的挑战是什么?

　　一、ctDNA-MRD在预测CRC复发或转移中的作用及面临的挑战

1. MRD定义的回顾

   
   

　　MRD的表述源于血液肿瘤，从血液肿瘤扩展到实体肿瘤。在实体瘤中MRD定义在文献中可看到3种不同的表述，美国NCCN指南同时使用了微小残留病灶(Minimal Residual Disease)和可测量残留病灶(Measurable Residual Disease);临床专家和一些文献使用了分子残留病(Molecular Residual Disease)。它是血液样本中代表肿瘤复发的生物标志物，因为一些癌症(CRC、胃癌、乳腺癌、肺癌等)患者在接受治愈性治疗后仍会复发，可能的原因是患者体内持续存在的残留肿瘤细胞或与肿瘤密切相关的DNA片段(ctDNA)及异常分子，虽然患者没有肉眼可见的病灶，但确实存在传统影像学(CT、MRI、PET-CT、B超等)方法无法发现的MRD，最终可能导致癌症复发或转移。

　　2. 实体瘤ctDNA-MRD检测技术

　　近年研究结果显示，通过ctDNA-MRD技术可能发现MRD。目前，实体肿瘤ctDNA-MRD技术主要分为两大类：①肿瘤组织先验法/肿瘤知情分析(tumor-informed assays)：通常需要对患者原发肿瘤组织进行测序以鉴定患者的特异基因组变异图谱，然后设计引物定制个性化的基因组合(panel)进行ctDNA检测分析，并进行基因突变监测，其特点为组织-血浆，个体化，敏感度较高，已被证明可以预测癌症术后复发风险，但整体检测流程较为复杂。②肿瘤组织未知分析法/肿瘤未知情分析(tumor agnostic assays)：无需原发肿瘤组织，采用预先设计的与癌症驱动基因相关的固定panel进行ctDNA检测分析，仅需要患者的体液标本，非个性化，但可以缩短检测时间，敏感度相对较低。两种检测技术之争孰优孰劣尚未定论。国内外研究者通常将MRD分为阳性和阴性两种状态。研究表明，MRD阳性结果意味着癌症治疗后仍可检测到微小残留病灶，预示着复发可能性较大，预后较差;阴性结果则提示微小残留病灶存在的可能性很小，预后较好，可能有更长的缓解期和生存期。

　　3. ctDNA-MRD在预测CRLM复发方面具有较大的潜力

　　对于CRC复发或转移风险低的患者，应该避免过度治疗给患者身体带来的伤害，而对于CRC复发或转移风险高的患者，应该接受更为安全有效的辅助治疗以及密切监测复发或转移。鉴于以上存在的问题和面临的挑战，国内外学者和临床专家团队对ctDNA-MRD技术进行不断地研究和改进。截至目前，最新公开发表的文献显示，ctDNA-MRD技术的“金标准”趋向于”肿瘤知情分析”的个性化定制，使其在预测复发和转移方面发挥作用。

　　2023年，北京大学肿瘤医院邢宝才教授团队通过肿瘤知情分析技术和超高深度NGS检测结直肠癌肝转移(Colorectal Liver Metastases，CRLM)根治性治疗后MRD.

　　利用超高深度NGS开发了一个新的J25 panel，包含与CRLM预后相关的25个基因。利用超高深度NGS技术分析CRLM患者术后外周血的ctDNA预测CRLM患者的复发和生存情况，研究结果发表在《肿瘤外科学年鉴》(Annals of Surgical Oncology)。该项研究对134例接受根治性肝切除术的CRLM患者，选择肿瘤知情分析技术，采用642-panel检测手术组织样本;J25 panel检测术后外周血，样本采集时间中位数为术后第6天。有42个(42/134，31.3%)样本被鉴定为ctDNA阳性，其中有37例患者复发。Kaplan-Meier生存分析显示，ctDNA阳性亚组的无病生存期(disease-free survival，DFS)和OS显著短于ctDNA阴性亚组。研究结果证实，选择肿瘤知情分析，利用J25 panel和超高深度NGS技术分析CRLM患者术后外周血的MRD敏感性和特异性更高。接受根治性肝切除术的 CRLM患者术后第6-7天进行ctDNA-MRD检测获得的MRD信息能够评估DFS，如果在根治术后实施纵向动态监测可以预测复发。

　　4. ctDNA-MRD在监测I-III期CRC复发风险发挥作用

　　既往的研究显示，ctDNA-MRD可预测I-III期CRC术后MRD状态。I-III期CRC患者的MRD状态动态变化对辅助治疗决策具有重要的参考价值。在2023年第20届美国临床肿瘤学会胃肠道肿瘤研讨会(ASCO GI)口头报告专场中，由美国多个医疗机构合作的研究团队发布了题为《I-III期CRC患者术后ctDNA-MRD检测时机及对MRD检出率的影响》回顾性研究。该项研究于2019年6月至2022年4月，使用事先通过肿瘤组织标本测序获取其基因突变信息的肿瘤知情分析和以多重PCR为基础的二代测序分析(肿瘤MRD检测技术Signatera)，对14425例I-III期CRC患者术前和术后进行纵向ctDNA-MRD检测分析，在术后不同时间点分析MRD检出率的动态变化，复发患者和未复发患者的中位随访时间分别是730天和615天。分析数据显示，术后第1周MRD检出率较高;术后第2-4周MRD检测的敏感性与术后第5-8周相似;MRD检测时间窗的起始时间早可在术后2周。研究结果为术后ctDNA-MRD检测时机提供了可参考的数据。

　　2023年4月，复旦大学附属肿瘤医院大肠外科蔡三军和蔡国响教授团队历时四年研究，在国际顶级肿瘤学期刊《美国医学会杂志-肿瘤学》(JAMA Oncology，IF=33.012)发布了关于《ctDNA甲基化监测I-III期CRC分子残留病及危险分层》的新研究成果。该研究结果明确地将基于ctDNA的分子残留病定位为I-III期CRC复发的显著风险因素，且与肿瘤分期和其他经典临床病理风险因素无关。此外，该项研究将ctDNA分子残留病检测与CEA水平分析相结合，提高了CRC患者复发转移的预测效果。进一步证实液体活检是一种简单且具有成本效益的检测手段，可以预测I-III期CRC患者根治手术后复发风险。在临床实践中，更有利于对I-III期CRC患者根治手术后复发风险实施整体无创监测及分层管理，并可在提升CRC患者整体生存率方面发挥作用。

　　5. ctDNA-MRD面临的挑战

　　ctDNA的动态变化和MRD清除率可以极大地帮助评估CRC患者的综合治疗效果，但在肿瘤临床诊疗实践中，应科学、理性地选择和合理应用ctDNA-MRD技术。因为ctDNA-MRD仍存在未知问题，面临诸多的挑战：①首先检测需有LBx和NGS设备及检测技术平台，ctDNA的检测成本远高于传统组织活检，高的检测费用增加了患者的经济负担。基于卫生经济学方面的考虑，其与临床广泛应用之间仍有一定的距离，目前多限于临床研究;②由于MRD检测是通过外周血采样，但8ml-10ml血标本所能提取的ctDNA比例不高，所以对检测精度要求达到0.005%;③ctDNA的释放受多种因素影响，而且实体瘤早期释放到外周血中的ctDNA含量低于1%，使得检测的灵敏度受限，对早期复发的MRD检出率低。腹膜转移或脑转移患者可能因血脑屏障等原因，使MRD检出率和准确率更低。因此，很难获得MRD清零的真实信息;④由于克隆性造血(生物学噪音)的存在会影响生物信息学分析，如果没有优质的的除躁或降噪设备及技术进行处理，机器程序或工作人员可能会将估算出的来自干扰源的分子误判为来自肿瘤ctDNA，出现假阴性，或假阳性。MRD检出的准确性下降会影响临床诊疗策略的精准实施;⑤检测技术平台为了提高灵敏度而增加追踪变异的数量所带来的多变异信号整合也可能会影响检测特异度和准确性;⑥测序覆盖度(coverage)有平台期，达到此期时便不能随测序深度增加而显著变化，往往无法覆盖所有待测测序目标区域(panel)。没有获得测序的目标区域就称为Gap(%)，Gap占比越高，检测结果假阴性风险就越高;⑦ctDNA-MRD检测技术尚未标准化，影响了临床应用与推广。特别是对于肿瘤细胞占比(血液除外)、核酸总量、平均测序深度的三个关键质控指标缺乏统一的质量控制标准和评价体系，存在增加检测结果假阴性风险。此外，“肿瘤知情分析”与“肿瘤非知情分析”两大类技术争论不休，仍有许多复杂的问题需要深入探究。

　　二、脂质代谢物能否成为预测结直肠癌复发和转移的标志物?

　　目前研究已经发现人体内有大于1000个基因异常与癌症相关，并诞生了与此相应的肿瘤细胞自身或局部的微环境。国内外学者对癌症机制的探究和理解虽然取得了较为显著地进展，但在许多机制上的疑团仍没有解开，使得癌症防治策略仍然有待进一步开发。在对于ctDNA-MRD面临的挑战暂无更好的措施时，能否再辟蹊径，探究新的生物标志物?

　　2018年2月，癌症代谢治疗领域国际著名学者、美国波士顿学院生物学教授Seyfried博士提出了“癌症是一种代谢病”的全新观点，开启了癌症作为一种代谢病和系统性疾病复杂机制的研究热潮。高脂肪饮食和血脂异常及肥胖与CRC之间的流行病学关联已经被报道了多年，但目前对脂质组学和脂质生物标志物与CRC预后的相关性亦不清楚，特定脂质代谢物在CRC发生发展中的作用尚不确定。

　　2020年美国范德堡大学的相关研究人员在《脂质研究进展》(Progress in Lipid Research，IF=15.08)杂志发表了题为《肿瘤微环境中的脂质：从癌症进展到治疗》的综述，深度总结了肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)中的脂质与多种癌症的发生发展密切相关。TME中的脂质可对癌症的进展，免疫反应、治疗、复发与转移产生巨大影响。强调了围绕脂质代谢和信号通路进行癌症治疗干预的重大潜力，监测癌症患者脂质代谢变化、控制血脂水平对癌症患者预后评估及预测复发具有重要价值。新研究结果显示，癌症是一种复杂的代谢病，癌症源于代谢紊乱，没有代谢紊乱就没有基因突变。脂质代谢紊乱会刺激肿瘤生长、免疫逃逸、癌症复发或转移。血脂中的主要成分是甘油三酯和胆固醇。人们谈到血脂升高时首先会与肥胖、心脑血管疾病联系在一起。然而越来越多的研究证实，CRC、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、甲状腺癌、肝癌等癌症的发生发展与脂质代谢紊乱有关。

　　2023年，Sedlak等在《生理学年鉴》(Annu Rev Pathol，IF=36.1)杂志发表题为《代谢与CRC关系》的综述中，强调代谢与CRC关系密切，脂质代谢重编程在肿瘤演进中发挥重要作用，重编程代谢是CRC的一个重要标志。细胞代谢紊乱是CRC发生的关键机制，大多数CRC的起源细胞LGR5+ISC具有高度增殖性，并且与CRC具有相似的代谢特征。对可改变危险因素的代谢反应可能是50岁以下早发性CRC发病率上升的原因。越来越多的临床前和临床研究表明，细胞代谢紊乱是CRC复发或转移的重要驱动因素。2024年，Harewood等在《生物医学》(EBioMedicine，IF=11.1)杂志发表题为《循环脂质代谢物与CRC风险的相关性：欧洲癌症与营养前瞻性调查(EPIC)的巢式病例对照研究》报告，研究人员分析了97种脂质代谢物(包括酰肉碱、甘油磷脂和鞘脂)的循环水平与CRC风险的关联。使用靶向质谱法测量1591例CRC病例(55%为女性)和1591例匹配对照的循环脂质代谢物水平。在经过多重校正后，两种脂质代谢物羟基鞘脂(SM(OH) C22:2)和酰烷基磷脂酰胆碱(PC ae C34:3)显示与CRC风险呈显著负相关，其OR值分别为0.60(95% CI：0.47-0.77)和0.71(95% CI：0.59-0.87)。该项研究通过分析特定脂质代谢物与CRC风险之间的关联，为了解脂质代谢在CRC发展中的潜在作用提供了重要线索。特别是羟基鞘脂和酰烷基磷脂酰胆碱的下降与CRC风险相关。可以说脂质代谢改变是癌症发生发展的潜在标志，有可能有助于开发基于脂质代谢物预测CRC预后的标志物。

　　2024年，兰州大学金卫林教授团队联合安徽医科大学徐阿曼教授团队，在《国际生物科学杂志》(International Journal of Biological Sciences，IF:9.2)期刊上发表题为《肿瘤微环境中胆固醇代谢:肿瘤标志物及治疗》的综述。

　　该文作者们聚焦于胆固醇代谢与TME的关系，系统地讨论了胆固醇稳态失调与癌症特征(hallmarks)之间的关系，提出胆固醇稳态的失衡与癌症发生发展密切相关，胆固醇稳态失调通过多种机制影响癌症的发生发展、转移和治疗抗性;系统地阐述了胆固醇代谢与TME之间的相互作用，胆固醇代谢介导TME细胞与细胞之间的信号交流在癌症发生发展中的重要作用，为靶向胆固醇代谢治疗癌症提供了理论基础，也为癌症防治提供了新的视角和新见解。通过深入探究胆固醇代谢在癌症hallmark中的作用，可能为预测结直肠癌复发和转移的标志物的研究提供新思路和有价值的研究方向。

　　高效液相色谱-质谱联用(High-performance liquid chromatography mass spectrometry，HPLC-MS)是将HPLC和质谱(mass spectrometry，MS)两者优点组合在一起的新技术，既具有良好的分离分析能力，高通量、高灵敏度、高特异性、高分辨率和信息量大的特点，又适合分析纯样品和复杂混合样本;既适合定性分析，又适合定量分析，且定性和定量分析均精准，是代谢组学中技术全面、应用为广泛的分析方法。本文作者的研究思路是采用HPLC-MS技术对治疗前后CRC患者进行了脂质代谢组学分析，分离鉴定脂质代谢物，在筛选出对CRC发展所特有的“致脂表型”生物标志物后，与公认的脂质组学数据库对接，并利用筛选出的“致脂表型”生物标志物，在治疗后的I-III期CRC和转移性结直肠癌(mCRC)入组患者中开展大样本临床试验，进行拟靶向脂质代谢组学分析，利用在线软件进行数据处理和多变量、单变量预后分析，观察“致脂表型”生物标志物与癌胚抗原(CEA)预测CRC术后复发的差异，明确“致脂表型”生物标志物与CRC患者治疗后DFS 的相关性以及在预测CRC患者治疗后复发风险中的作用。

　　结语

　　CRC术后复发或转移是导致CRC患者治疗失败和死亡的主要原因之一。ctDNA-MRD在预测CRC复发或转移方面具有较大的潜力和应用前景，但也面临困惑和挑战。将视野和关注度聚焦于癌症是代谢病、脂质代谢紊乱与CRC复发或转移密切相关上，采用先进的HPLC-MS技术，分离鉴定I-IV期CRC脂质代谢物，筛选对CRC发展所特有的“致脂表型”生物标志物，对治疗前后CRC患者进行了脂质代谢组学分析和预后分析。如果能达到预期目标，对CRC患者预后评估及预测复发可能具有重要价值，可能在评估CRC患者预后及预测复发的有效手段上与ctDNA-MRD并驾齐驱，或实现超越。

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